1、1生物技术实践讲义实验 1 大肠杆菌的培养和分离以及分离以尿素为氮源的微生物知识要点： 微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状 DNA 分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但也有一些菌株对人体是有害的，可以侵袭肠黏膜并
2、产生毒素。但是，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。细菌的分离方法有两种：划线分离法和涂布分离法。是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离就是用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线的过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线最后，可使细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培养 1020 小时后，一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞，这些细胞紧紧聚集在一起，形成菌落，不会重叠。在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常
3、有抗性基因（如抗氨苄青霉素基因），如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。涂布分离时，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释 10-510 -7 倍，然后取 0.1ml 稀释度不同的菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落。通常每个培养皿中有 20 个以内的单菌落为最合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂。 在培养微生物时，必须进行无菌操作。2其首要条件是各种器皿必须是
4、无菌的，如各种大小的培养皿、试管、三角瓶、取样器的头（或称“枪头”）、称液管、三角刮刀、接种环、镊子等等。这些用具通常用高压蒸汽灭菌法灭菌。各种培养基也必须是无菌的，转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌，必须在酒精灯火焰旁操作（防止杂菌污染）。培养基在 121 （1kg/cm2 压力）下，灭菌 15min。值得注意的是，实验中所需的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。灭菌后，通常将实验用具放入 6080的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用 500g/cm2 压力（90以上）灭菌 30min。
5、有些不能加热灭菌的化合物，如尿素（加热会分解），只能用 G6 玻璃砂漏斗过滤，但玻璃砂漏斗使用前也要在121下用纸包好灭菌。玻璃砂漏斗用后需用 1mol/L 的 HCl 浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。进行恒温培养时，要将培养皿倒置，是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，不倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互影响，很难在分成单菌落，达不到分离的目的。 细菌扩大培养要用 LB 液体培养基 （通用培养基、常用于做生理学研究和发酵工业），划线分离要用 LB 固体培养基（常用于微生物 分离、鉴定、计数和菌种保存）
6、。“细菌喜荤，霉菌喜素”，通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。尽管培养基的配方各不相同，但其基本成分都一样。在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37培养 24h 后，置于 4冰箱中保存。问题：1微生物、细菌与大肠杆菌之间有怎样的关系？2培养大肠杆菌的 LB 培养基中有各种物质，为什么选择这些物质，这些物质有什么作用呢？人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出了供其生长繁殖的营养基质培3养基。虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有五大营养要素，即水、无机盐、碳源(提供碳
7、元素)、氮源(提供氮元素)和生长因子(不同的细菌需要的各不相同，有物种差异，它主要补充自身不能合成的或合成能力较弱的，但却是生长繁殖必需的物质)。无机盐作用：维持渗透压、pH 等3该实验中这些操作的原因将大肠杆菌用接种环自斜面转移到液体培养基中培养时，为什么接种环必须先深入到斜面冷却后，才能再取斜面上的菌体？接种环在取菌体前曾在酒精灯火焰上灼烧灭菌，一直灼烧至红，温度很高，若不冷却就直接用其取斜面上的菌体，菌体可能因为接触高温接种环而死亡，导致大肠杆菌的转移培养失败。用划线法分离大肠杆菌中，第一次和随后的几次划线前都要灼烧接种环，它们的原因一样吗？在划线结束后仍然要灼烧接种环这又是为什么呢？虽
8、然每次灼烧都是为了灭菌，但所灭的菌种和原因却不一样。用划线法分离大肠杆菌时，每次的划线是怎么样的？对随后的划线的起点有什么要求？为什么这样要求呢？划线的要求：不能出现线条的重叠，第二次以及随后的划线操作，总是从上一次划线的末端开始，不要将最后一区的划线与第一区相连这样要求的原因：使线条末端细菌的数目比线条起始处要少，因为划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线灼烧接种环的时间 消灭的菌体 原因第一次划线前 其他杂菌 防止其他杂菌的侵入而造成污染随后的几次划线前上次划线结束后残留在接种环上的实验菌(本实验为：大肠杆菌)为了使下一次划线时，接种
9、环上的菌来自上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，最终获得单个菌落，实现菌的分离最后一次划线结束后残留在接种环上的实验菌为了防止实验菌残留于接种环而污染环境和感染实验人员4次数的增加而逐渐减少，最终得到有单个细菌繁殖而来的单菌落。若相连，则可能最后一次划线末端处的细菌与第一次的叠加，细菌的数目不是最少的，不能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终将很难获得单菌落4消毒与灭菌一样吗？消毒：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法：在 100煮沸 56 min 一般物品巴氏消毒法：7075煮
10、30 min 或在 80煮 15 min 对于一些不耐高温的液体，如牛奶化学药剂消毒法 如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等灭菌：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子) 灼烧灭菌：酒精灯火焰 接种工具的灭菌干热灭菌：160170 下灭菌 12 h 玻璃器皿、金属工具的灭菌高压蒸汽灭菌：121 （1kg/cm 2压力）下，灭菌 1530 min 培养基及容器的灭菌课后作业1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?胆大心细，操作快捷。注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染几率，手和实验服要清洁，减少操作时间，对污染源的改善考虑周到。注意微生物生长条件，如pH、渗透压、温度等。细菌
11、喜中性偏碱性环境，喜蛋白质丰富的物质营养，喜 37的温度；而霉菌喜中性偏酸性环境，喜糖类丰富的物质营养，喜 2530的温度。因此，知己知彼也可以减少污染。2.培养后如何判断是否有杂菌污染？从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等等，是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌的关键指标。用显微镜镜检观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌的关键指标。上述方法较难区分同类的不同物种，需要借助化学方法和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法，观察有无鞭毛、孢子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、芽孢、毒素及特异生理生化性质等。3.进行恒温培养时，为什么要将培养皿倒置?
12、恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落人培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单5菌落，达不到分离的目的。因此恒温培养时，培养皿必须倒置。4.实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理?实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤 30min
13、，再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可再使用。 5.如果分离的是转基因的工程菌，如何保证没有被普通的大肠杆菌污染?转基因用的质粒，不是细菌中原有的质粒，而是通过改造的，通常加入了抗性基因的DNA 序列，如抗氨苄青霉素基因。转基因载体(质粒)转化进人大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，而未被转化的就不能生长，其他没有抗氨苄青霉素基因的杂菌也不能生长，这种设计保证了转基因工程菌的纯洁性。在获得转基因工程菌后，如果为了选择高表达菌株等进行分离，也可使用含抗生素的培养基，这就保证了转基因工程菌不被普通(无抗性基因)的大肠杆菌所污染。实验 2 分离以尿素为氮源的微生物脲也称尿素，是蛋白质降解的产
14、物。人和其他哺乳动物的尿中都含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染。尿素也是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。有一些细菌含有脲酶，它们可以通达降解尿素作为其生长的氮源。这类细菌可以从土壤中分离出来。脲酶（NH 2） 2COH 2O2NH 3CO 2本实验的内容是从土壤中分离出能利用尿素的细菌，观察菌落数，并了解它在生态平衡中的作用。以 LB 全营养培养基为对照，观察全营养生长的细菌的菌落数。材料：1 在 100mL 烧杯中装入 50mL70%酒精，将玻璃刮刀浸泡在其中。2 在 100mL 三角瓶中配制好 25mL 全营养 LB
15、 固体培养基（0.25g 蛋白胨，0.12g 酵6母提取物，0.25gNaCl 和 0.5g 琼脂糖，水 25mL） ，加上封口膜后灭菌待用。3 在 100mL 三角瓶中配制好 25mL 尿素固体培养基（0.025g 葡萄糖，0.12gNaCl， 0.12gK2HPO4，0.25g 酚红和 0.5g 琼脂糖，水 15mL） ，加上封口膜后灭菌，待冷却至 60时，加入通过 G6玻璃砂漏斗过滤的 10mL 尿素溶液（内含 2g 脲） ，摇动，法例均匀后待用。4 将装有 4.5mL 蒸馏水的 5 支有塞试管灭菌后待用。5 在 250mL 三角瓶中装入 99mL 蒸馏水，用封口膜盖上，灭菌后待用。6
16、土样 1g（从有哺乳动物排泄物的地方取得）步骤：1 在 60左右时，将两只三角瓶中已灭菌的 LB 固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。2 制备细菌悬液。在无菌条件下，将 1g 土样加到有 99mL 无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成 102 土壤稀释液。依此法制备 10-3、10 -4和 10-5土壤稀释液。取样时，尽量只取悬液。摇匀，放在试管架上。3 用涂布分离法分离细菌。取 10-4和 10-5的土壤稀释液各 0.1mL，分别加到有 LB 培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在 70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上
17、火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上4 将培养皿倒置，在 37恒温箱中培养 2448h。观察菌落数5 观察。全营养培养基中有较多的菌落，而尿素为氮源的培养基平板中只有少量菌落。问题探究1. 用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基，因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。配制尿素固体培养基时，葡萄糖应用 500g/cm2压力灭菌 30min（为防止葡萄糖碳化） ，尿素需经细菌 G6玻璃砂漏斗过滤灭菌后加入。72. 实验操作中的注意事项设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，至少要涂布 3 个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性
18、。对照实验判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同量进行培养。LB 培养基和选择培养基应各有一个空白对照，即不涂布菌液，目的是验证培养基中是否含有杂菌判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立 LB 全营养培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行比较得出结论。实验结果分析培养基中酸碱指示剂产生颜色变化，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。红色区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少与全营养培养基上的菌落数比较，尿素培养基上只有少数菌落，这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占少部分。3.鉴定方法：含酚红指示剂、以尿素为唯一氮源的培养基细菌指示剂变红，
19、则该细菌能分解尿素实验 4 果汁中的果胶和果胶酶果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成的一种高分子化合物，果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散。果胶不溶于乙醇（也不溶于水），这是鉴别果胶的一种简易方法。在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶能够分解果胶，分解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得更容易，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，也使得浑浊的果汁变得澄清。果胶酶并不是特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，包括果胶酶和果胶甲酯酶等。有些微生物，如黑曲霉、苹果青霉等都可用于生产果胶酶。 在 食 品
20、 工 业 ， 果 胶 酶 主 要 应 用 于 水 果 加 工 业 ， 主 要 有 ： 水 果 中 的 果 胶 经 果 胶 酶 水 解 后 ，8可 降 低 果 汁 的 粘 度 ， 有 助 于 压 榨 并 提 高 出 汁 率 ； 在 进 行 果 汁 沉 降 和 离 心 时 ， 能 破 坏 果 汁 中悬 浮 物 的 稳 定 性 ， 使 其 凝 聚 沉 淀 ， 果 汁 得 到 澄 清 ； 经 果 胶 酶 处 理 的 果 汁 比 较 稳 定 ， 不 再 发生 混 浊 ； 在 葡 萄 酒 酿 造 中 加 入 果 胶 酶 能 起 到 澄 清 作 用 ， 还 可 促 使 葡 萄 汁 中 的 酒 石 酸 发 生
21、 沉淀 ； 本实验的内容是探究利用苹果或山楂匀浆制作果汁的最佳条件、检测果胶酶的活性、了解果胶酶对果汁形成的作用和收集果胶酶的应用材料。步骤：1 用小刀除去苹果或山楂果实中带种子的部分，并切成块，加入少量水制成匀浆。2 取两个 100mL 的烧杯，编号 A、B，各加入 5g 匀浆，再向 A 号烧杯中加入 10mL 黑曲霉的提取液或果胶酶溶液，B 号烧杯中加入 10mL 水，间歇搅拌 2030min。3 取 4 支试管，编号 14。将 A 烧杯中的混合物放入 1 号和 2 号试管中，每管放入4mL；将 B 烧杯中的混合物放入 3 号和 4 号试管中，每管也放入 4mL。将 1 号和 3 号试管放
22、在沸水浴中或酒精灯上加热，观察有何变化？2 号和 4 号试管不加热。4 再向上述 4 支试管中各加入 95%的乙醇 4mL，观察有什么变化？将观察结果记入右表中。问题：1.制作果汁的最佳条件是什么?品质最好的果汁应该是：尽量保留水果中的营养成分。具有水果的原始口味。有更多的固形物。分散程度好，不沉淀，不上浮。有原始的水果色彩。烧杯号 管号 处理 加酒精前现象 加酒精后现象1 加热A2 不加热3 加热B4 不加热9除去所有的机械组织，更易消化。因此，能使最多的水果成分溶解或分散在果汁中的条件就是最佳条件，达到这些条件的方法要温和，且对人体无害。2.果胶酶在制作果汁中起什么作用?果胶是细胞间的黏连
23、成分，也是果汁中的成分，加入果胶酶可将细胞离析，增加固形物的分散度。此外，还降低了水果匀浆悬液的黏度，有利于过滤掉不溶物，并使果胶分解成半乳糖醛酸。3.果胶酶还可能有什么作用?果胶酶除用于制备果汁外，还用于果酒澄清，同时也作为洗衣粉的添加剂。加果胶酶的洗衣粉可除去衣服上的果汁、果酱等污垢。4实验验步骤中用玻璃捧间歇搅拌 20 min30 min 的目的是什么?使酶和反应物(果胶)充分接触，有利于化学反应的进行。5实验中加热和不加热有什么区别?为什么?沸水浴中或酒精灯上加热会使酶失活，试管中加不加酶结果都一样；不加热时酶保持活性，加酶的试管中果胶水解，而加水的试管中果胶不能水解。6实验中加入 9
24、5的乙醇 4 mL 后，出现什么现象，为什么?果胶不溶于乙醇，可以用乙醇来鉴别果胶。加入 95的乙醇 4 mL 后，含有果胶的试管会出现沉淀，而果胶被水解后不出现沉淀。7当探究温度对黑胶酶活性的影响时，哪个因素是变量，哪些图素应该保持不变?温度是变量，应控制果泥量、果胶酶的浓度和用量、水浴时间和混合物的 pH 等所有其他条件不变。只有这样才能保证只有温度一个变量对果胶酶的活性产生影响。10实验 6 淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测酶是生物体内各种化学反应的催化剂，它有高度的专一性和高效性。但酶在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。固定化酶就是水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使
25、之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法。将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。实验内容是用吸附法将 淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示剂溶液（KI-I 2溶液）测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。淀粉酶 淀粉酶 糖化淀粉酶淀粉糊精麦芽糖葡萄糖遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色这 里 使 用 的 是 枯 草 杆 菌 的 淀 粉 酶 ， 其 作 用 的 最 适 H 为 5.5 7.5， 最 适 温 度 为50 75材 料 ：淀粉酶的固定化。在烧杯中将 5mg淀粉酶溶于 4mL
26、 蒸馏水中。由于酶不纯，可能有些不溶物。再加入 5g 石英砂，不时搅拌，30min 后装入 1 支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中（石英砂体积约为 4mL） 。用 10 倍体积的蒸馏水洗涤此注射器以除去未吸附的游离淀粉酶，流速为 1mL/min步骤：1将灌注了固定化酶的注射器放在注11射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，使淀粉溶液以 0.3mL/min 的流速过柱。在流出 5mL 淀粉溶液后接收 0.5mL 流出液，加入 12 滴 KI-I2溶液，观察颜色。用水稀释 1 倍后再观察颜色2 实 验 后 ， 用 10 倍 柱 体 积 的 蒸 馏 水 洗 涤 此 柱 ， 放 置 在 4 冰 箱 中 ，
27、 几 天 后 再 重 复 上 述实 验 ， 看 是 否 有 相 同 的 结 果 。问 题 ：1 与 普 通 的 酶 相 比 较 ， 固 定 化 酶 有 什 么 优 点 ？酶固定化后有一定的机械强度，催化反应的过程要连续化、自动化；酶不溶解在催化反应的溶液中，产物更易纯化；固定化酶可反复使用，更经济，更利于工厂化生产；固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间贮存和使用。2如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶？可 在 试 管 中 加 入 1mL 可 溶 性 淀 粉 ， 再 加 入 几 滴 淀 粉 酶 柱 的 流 出 液 ， 混 合 后 用 手 握 住 试 管增 加 温 度 ， 几 分 钟 后 加
28、 1 2 滴 KI-I2溶 液 指 示 剂 ， 如 仍 呈 蓝 色 ， 即 流 出 液 中 没 有 淀 粉 酶 了 。实验 8 果酒及果醋的制作与酒和醋的生产有关的微生物分别是酵母菌（真菌）和醋杆菌（细菌） ，它们各有不同的菌种。菌种的不同，所产生的酒和醋的风味也不同。本实验的内容是制作果酒和果醋，所用的原料是葡萄或其他果汁。葡萄酒是酵母利用葡萄糖进行酒精发酵(乙醇发酵)的产物。酵母菌只有在无氧条件下才能进行酒精发酵，即将葡萄糖氧化成乙醇，而且当培养液中乙醇的浓度超过 16时，酵母菌就会死亡。葡萄糖氧化成乙醇的反应式如下：C 6H12O62CO 2+2C2H5OH醋杆菌在有氧条件下才能将乙醇氧
29、化为醋酸，醋杆菌所产生醋酸可使培养液中醋酸的含量高达 13。其反应式如下：C 2H5OH+O2CH 3COOH+H2O12将适量干酵母放在一小烧杯中，加入少量温水，使干酵母成为糊状。为使酵母迅速发生作用，可加极少量蔗糖，混匀，放置片刻。待酵母悬液中出现气泡即可。用葡萄制作葡萄酒时，一般不加蔗糖，都只用野生酵母，但是本实验为了加速反应，使观察更直观，需要有更多底物参加反应，所以加入酵母使酒精发酵占有优势。使用高锰酸钾溶液浸泡葡萄的目的是为了防止杂菌污染，也是消灭了野生酵母。发酵瓶中的液体不能装满（装量不超过 2/3）是因为发酵过程中气体产生，如果装满会使液体外溢，导致发酵液损失和瓶口等处污染杂菌
30、，影响产物品质。用装着水的弯曲玻璃管可以防止氧气进入，发酵产生的二氧化碳可以出去，还可以防止空气中杂菌的污染。 制醋有固态发酵和液态发酵，本实验属于固定化菌体连续发酵工艺。制醋时要向发酵瓶中通入空气，保证发酵是一个氧化过程，要用棉花过滤是 防止空气中的微生物进入。问题：1葡萄或其他果实上常有天然的野生酵母存在，为什么上述两个实验都要接种酵母？生产葡萄酒时一般不加蔗糖，都只用野生酵母。本实验为了加速反应，使观察更直观，需要有更多底物（蔗糖）参加反应，所以加入酵母使酒精发酵占有优势是必须的。否则会有许多霉菌生长，出现异味，影响质量。2为什么发酵瓶中的液体不能装满？从以葡萄糖为底物发生乙醇发酵的反应
31、式看，1 个葡萄糖分子经乙醇发酵后要产生 2 个CO2 分子，因此，发酵过程中有气体产生。如果发酵液装满容器，则液体将外溢，一则发酵液会损失，二则瓶口等处会被许多杂菌污染，特别是被霉菌污染，将影响产物品质，所以发酵液不能装满。3图中装着水的弯曲玻璃管起什么作用？装着水的玻璃管可防止氧气进入。由于厌氧发酵过程中有 CO2 产生，使瓶内压力加大，CO2 气体可以从装有水的玻璃管中出去，减小瓶中的压力。此外，有水封闭也起着防止被空气中杂菌污染的作用。4制酒时必须保证所有用具都是清洁的，为什么？不论是葡萄或是其他水果，对微生物来将都是良好的培养基，特别是霉菌。空气中有许多霉菌孢子，也有细菌，如果用具不
32、清洁，就等于向果汁中接种了许多杂菌，它们都可以利用糖繁殖菌体。这样，我们饮用的就不会是果酒，而是杂菌的培养液了，轻则会影响我们饮用的口感，重则会影响我们的健康。5为什么要向发酵瓶中通入空气？从乙醇进行醋酸发酵的反应式看到，反应是一个氧化过程，需要空气中的氧气，因此要向发酵瓶中通入空气。6为什么空气要用棉花过滤？13甲瓶中的酒水混合物和乙瓶中的锯末都含有微生物可利用的养分，进入的空气含有大量微生物，经棉花过滤可防止微生物进入。7你所得到的丙瓶中的液体是否就是市售的白醋？为什么？怎样才能得到白醋？市售白醋中除醋酸外，还含有丰富的不挥发性酸、糖、酯、醇等物质，这些物质多为加入的酵母所产生。只有醋酸不
33、能达到口感好、有香气的目的。在生产中将一部分丙瓶产物加工成成品，另一部分再与甲瓶溶液一起进入乙瓶，这样可增加口感。最后的成品需要调兑、过滤、化验，再包装成成品，如光华白醋的流出液含酸可达9.09.5，而成品中只有 5，要经上述过程才能得到市售类型的白醋。8.为什么在酒精发酵过程中往往“先通气后密封”？“通气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖。 “密封”的目的是使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精 。9.酒精发酵过程中发生“先来水后来酒”现象，其原因是什么？酵母菌首先进行有氧呼吸产生了水，然后进行无氧呼吸才产生酒精。10.葡萄酒呈现深红色的原因？ 在发酵过程中葡萄皮的色素进入到发酵液中。11.酵母菌
34、是如何进行生殖的？酵母菌在环境适宜时进行出芽生殖，环境不适宜时产生孢子进入休眠状态。12果醋制作原理利用的微生物是醋酸菌 ，其异化作用类型是需氧型。明确醋酸发酵的反应式。13.醋瓶子、未喝干的啤酒瓶子放置久了，在醋和啤酒表面形成一层“白膜” 。它是怎样形成的？ 醋酸菌大量繁殖形成的14利用酒精发酵制作果酒过程中其影响因素主要有哪些?影响酒精发酵的主要环境条件有温度、氧气和 pH 值。 酒精发酵是一般将温度控制在 2530。 酒精发酵过程中，要保持缺氧、酸性环境(pH 为 4.0-5.8)。15影响醋酸发酵的环境因素有哪些？ 温度、氧气和 pH16在制作葡萄酒和葡萄醋的过程中，为什么要先冲洗葡萄
35、后去枝梗?这样做的目的是为了避免去枝梗时引起葡萄破损，减少被杂菌污染的机会，同时也可防止葡萄汁流失。17在果酒和果醋的制作过程中如何防止发酵液被污染?在果酒和果醋的制作过程中为防止发酵液被杂菌污染，实验中所用的榨汁机、发酵装置等器械要进行消毒，如用 70的酒精对榨汁机和发酵瓶消毒，同时还要使发酵装置处于封闭状态。18在果酒和果醋制作过程中都要充入氧气，其作用有何不同?果酒制作是利用酵母菌的酒精发酵，往往也要充入氧气，主要是让酵母菌大量繁殖，然后进行厌氧呼吸(酒精发酵)；而在果醋制作中是利用了醋杆菌的醋酸发酵，醋杆菌是14好氧型细菌，需要有氧气的参与才能进行。19在果酒发酵和果醋发酵过程中，对发
36、酵条件的控制有什么不同?果酒发酵和果醋发酵过程中，发酵条件主要是在对温度的控制要求和对氧气的要求上，即：温度不同，果酒发酵为 2530，发酵时间一般为 2 天3 天，若温度较低，发酵时间则相对延长；果醋发酵为 30。C35，发酵时间为 7 天8 天。对氧气的控制不同：果酒发酵应先通入氧气再隔绝空气，果醋发酵应不断通入足够的氧气。20制作果酒和果醋时，酒精浓度应控制在多少?果酒的酒精浓度一般控制在质量分数为 l0以上，这样才能较好地抑制微生物生长，使果酒不腐败。醋酸的浓度控制在质量分数为 4-5是制醋的关键。因为当浓度过高时，醋杆菌的生长就会受到抑制。因此，酒精浓度也应控制在质量分数为 5左右，
37、以提高酒精的转化率。实验 10 泡菜的腌制和亚硝酸的测定泡菜和酸菜都是人们喜爱的开胃食品，它是利用天然微生物进行发酵而制成的。这类食品类似于西方国家的酸乳制品。泡菜腌制过程中起作用的主要是假丝酵母和乳酸菌。但这类食品中含有一定量的亚硝酸盐，亚硝酸盐对人体有害，是致癌物质。本实验的内容是制作泡菜，所用的原料是白菜、洋白菜等。在无氧的条件下，微生物利用菜中的糖和其他营养物进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质等，其中也有亚硝酸(HN0 2)。在一定的发酵时间内，泡菜酸度适口，时间过长，则霉菌生长过多会产生霉变味。市场上有专用于泡菜的容器，它的口有一凹槽，凹槽加水再加盖，造成无氧条件。加白酒的作用是可
38、抑制杂菌的生长，也是一种调味剂，增加醇香感。加盐不要太多，否则会使乳酸菌发酵迟缓。温度高则发酵快，但口味差些。亚硝酸盐是对人体有害，引起中毒，可致癌的物质，由假丝酵母产生。亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与 N 一 1 一萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。实验步骤包括样品处理、测定、标准曲线（以亚硝酸钠质量为横坐标以光密度 OD 值为纵坐标）、计算。问题：151、加入白酒起什么作用？白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，它也是一种调味剂，可增加醇香感。2、用水封闭坛口，起什么作用？不封闭有什么结果？水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用，空气中 2 1是氧气，这是
39、最简易的造成无氧环境的方法。这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。如不封闭，则会有许多需氧细菌生长，蔬菜会腐烂。3、厌氧发酵和有氧发酵的产物有什么不同？乳酸菌产生乳酸属厌氧发酵；酵母产生乙醇属厌氧发酵；醋酸菌产生乙酸属有氧发酵，如继续进行有氧发酵，则产物被氧化而产生乙酸。此外，需氧微生物的作用也可使蔬菜腐烂。实验 11 植物的组织培养扦插、嫁接、分根、压条和组织培养等都是植物无性繁殖的方法。组织培养就是取一部分植物组织，如叶、芽、茎、根、花瓣或花粉等，在无菌的条件下接种在三角瓶中的琼脂培养基上，给予一定的温度和光照，使之产生愈伤组织，或进而生根发芽。为此必须在培养基中加入生长素和
40、细胞分裂素，两者的摩尔浓度比决定组织是生根，还是生芽。细胞分裂素生长素的比例高时，诱导芽的生成；两者摩尔浓度大致相等时，愈伤组织继续生长而不分化；两者比例低时，即生长素浓度相对大于细胞分裂素浓度时，才会趋于长根。本实验的内容是以菊花为材料进行组织培养。首先用细胞分裂素(cytokinin)相对较多和生长素(auxin)相对较少的培养基(发芽培养基)进行培养，使长出较多的丛状苗；然后将丛状苗分株培养。分株后，再移入含有较多生长素的培养基(生根培养基)中，使其生根；将生根的苗从三角瓶中移至草炭土或蛭石中继续生长；苗健壮后再移至土中。实验中使用的生长素是人工合成的萘乙酸（NAA） ，细胞分裂素也是人
41、工合成的苄基腺嘌呤（BA）材料：1.MS 培养基：由大量元素、微量元素、有机成分和琼脂组成。也可将大量元素、微量元素和有机成分配成浓度为配方的 510 倍的母液，用时稀释。2萘乙酸需用少量 0.1mol/L 氢氧化钠溶液溶解，苄基腺嘌呤需用少量 0.1mol/L 盐酸溶液溶解。也可配成母液冰箱中保存163发芽培养基4生根培养基植物组织培养过程：离体的植物组织、器官愈伤组织芽、根植物步骤：1.在超净台中，取出一瓶已进行过无菌培养的菊花幼苗，在无菌培养皿上用无菌镊子和无菌解剖刀切成几段，每段至少有 1 张叶片。2在酒精灯旁，将每段放入 1 瓶生芽培养基中，使茎的一部分插入培养基内，盖上封口膜。每瓶
42、也可放入 23 段幼茎切段。3在日光灯下保持 1825的温度培养，每天的光照不少于 14.5h。423 周后将生长健壮的丛状苗在无菌条件下一个个转入生根培养基中，在上述条件下继续培养。5待生根后，将苗移至草炭土或蛭石中，用玻璃罩或塑料布保持 80%以上的湿度，23 天后打开玻璃罩逐渐降低湿度进行锻炼，直到将罩全部打开处于自然湿度下为止。6再转移至土中培养（定植） ，即可长成植株并开花。7若使用自然生长的茎进行组织培养，则可取一段茎在 70%乙醇中浸泡 10min，再放入 5%次氯酸钠溶液中浸泡 5min，然后用另一 5%次氯酸钠溶液中浸泡 5min，最后在超净台中用无菌水清洗，将茎的切段培养在
43、生芽培养基中。1不同植物不同组织的生根和生芽是否使用与本实验相同的生长素和细胞分裂素浓度？不可。不同植物、不同组织所需的激素种类和浓度是不同的。2人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，为什么？植物中存在的天然激素都有相应的使之分解的酶，这样，无论激素在植物体内作用和存在的时间就较短，而人工合成激素在植物中没有相应于它的酶，所以作用和存在的时间长，作用效果明显。3在自然界取植物样本进行组织培养，你认为应采取什么措施保证样本不被污染？要注意 ：操作环境洁净。植物样本的洁净。4组织培养的过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作？组织培养过程中是如何进行消毒灭菌的？进行组织培养无
44、菌操作时应注意哪些问题？培养基非常适合细菌等微生物的大量繁殖，这些微生物在培养基上的生长不仅会分泌有害物质，促使外植体死亡，且会大量消耗营养，影响外植体的生长。组织培养过程中消毒灭菌：培养基和接种所需的物品应在高压蒸气灭菌锅中灭菌。在接17种的前一天，接种室用甲醛溶液和高锰酸钾熏蒸。准备接种时，提前 1 h 在接种室内用喷雾器喷洒来苏水，桌、椅也用来苏水擦拭。接种箱内用甲醛溶液和高锰酸钾熏蒸。在无菌室和接种箱内用紫外灯灭菌（无菌室照射 2050 min，接种箱照射 15 min） 。接种前，操作者要用肥皂清洗双手，擦干，再用酒精棉球擦拭双手。进行组织培养无菌操作时应注意的问题：接种时，应在接种箱内的酒精灯旁操作，接种用的工具要在酒精灯火焰上烧灼。接种时锥形瓶口应斜向火焰，在酒精灯火焰附近操作。接种后，将锥形瓶的瓶口在酒精灯火焰上转动烧灼一遍，用三层纸（两层硫酸纸中间夹一层薄牛皮纸）封盖瓶口，并将瓶口扎紧。用 70酒精溶液消毒恒温箱内壁。
