1、结核病实验室诊断技术,刘丹 阳文华,邵阳市疾病预防控制中心痰涂片实验室,Robert Koch Mycobacterium tuberculosis,结核分枝杆菌H37Rv全基因组大小为4 411 529bp，G+C含量为65.6%，基因组富含重复序列，特别是插入序列，以及新的多基因家族及管家基因，10kb以上的高G+C区域，即PE/PPE区域。整个基因组中G+C含量相对稳定 细胞壁富含长链脂肪酸，68%70%,分枝杆菌生物学特性,结核分枝杆菌是专性需氧菌，不形成芽孢、无动力的杆菌，空气中加入5%10% CO2会刺激其生长。最适pH为6.47.0。在3540均可生长，最适宜温度是37，但牛分枝
2、杆菌最适宜温度为361。生长缓慢，固体培养基上生长，代时为18h20h，形成肉眼可见的菌落一般需要8天-8周；但液体培养基上稍快，代时为14h15h。 分枝杆菌细胞壁中的脂肪成分不能被常用的苯胺染料着色。虽然革兰氏染色法很难使分枝杆菌着色，但它仍归类为革兰氏阳性菌，特定的染色程序可促进染色；一旦着色，分枝杆菌则很难脱色，即使是使用酸性乙醇也很难使分枝杆菌脱色，这一特性被定义为抗酸性（acid-fastness）。,结核分枝杆菌的抵抗力,结核菌对干燥或干热、冷冻抵抗力强； 对热敏感，60 1030分钟、80以上5分钟以内死亡。 对紫外线敏感，太阳光直射，27小时死亡，紫外线10W 50厘米，5毫
3、米厚度的菌悬液（10-1mg/ml）照射3分钟，可灭菌。结核病人的衣物、被褥、用品等可煮沸、或日光消毒。 对大多数消毒剂敏感，75%乙醇5分钟（可用于手消毒，但不能用于痰消毒，因为乙醇能凝固蛋白质）、0.1%升汞液10分钟、1%2%石炭酸5分钟，5%石炭酸1分钟，2%来苏儿液5分钟，0.1%1%过氧乙酸1小时，均可杀灭结核杆菌。121高压2060分钟，可灭菌。,实验室生物安全,结核分枝杆菌的感染剂量比较低（50%的感染剂量为10个菌细胞） 从现场标本中直接进行细菌分离培养、初步鉴定、药物敏感性试验、生化鉴定、免疫学试验、PCR核酸提取、涂片、显微镜检查等检测活动可在生物安全二级实验室中进行。
4、大量进行结核分枝杆菌培养、与大量耐药菌株接触或者进行危险性未知的试验时，需要具有生物安全3级水平的操作和设施的实验室。 动物感染实验要在动物生物安全三级实验室中进行,根据分枝杆菌分类国际研究班（IWGMT）的分类方案将本属细菌分为三类，即缓慢生长菌：结核分枝杆菌；Runyon（光产色菌） 、（暗产色菌） 、群（不产色菌） ；快速生长菌： Runyon 群；特殊营养要求：麻风杆菌；,Evolution of the Mycobacterium tuberculosis complex,From Brosch et al. PNAS 2002,M. canettii,实验室检测的标本,绝大多数做分
5、枝杆菌培养的标本来自呼吸道：痰、盥洗液 组织、胸水、腹水、尿液和胃液也是常用的标本。 血和粪便标本多来自AIDS患者。 关键点：采集合格的标本,病原检测、鉴定技术及应用,涂片染色显微镜检查 细菌培养固体培养、液体培养（常规、快速） 常规培养生化鉴定 分枝杆菌鉴定系统 分枝生物学鉴定技术多位点PCR鉴定，PCR-RLFPIS6100-RLFP, Spoligotyping，MLVA 应用病原学诊断病原学监测暴发流行的病原调查和溯源,涂片染色显微镜检查,病原检测、鉴定技术及应用-1,荧光染色技术抗酸染色技术,三、病原检测、鉴定技术-2,细菌培养固体培养液体培养,BACTEC MGIT960,常规培
6、养生化鉴定 耐热触酶试验堪萨斯分枝杆菌（+），结核分枝杆菌（-） 硝酸盐还原试验结核分枝杆菌（+），牛分枝杆菌（-） 吐温-80水解试验堪萨斯分枝杆菌（+），瘰疬分枝杆菌（-） 尿素酶试验试剂结核分枝杆菌（+），蟾蜍分枝杆菌（-） 芳香硫磺酯酶试验偶然分枝杆菌（+），结核分枝杆菌（-） 铁离子吸收试验偶然分枝杆菌（+），龟分枝杆菌（-） 亚碲酸盐还原试验胞内分枝杆菌（+），次要分枝杆菌（-） 烟酸试验结核分枝杆菌（+），牛分枝杆菌（-）,病原检测、鉴定技术及应用-3,PNB、TCH鉴别培养基鉴定,病原检测、鉴定技术-4,分枝生物学鉴定技术多位点PCR,病原检测、鉴定技术-5,分枝生物学鉴定技术
7、PCR-RLFP,病原检测、鉴定技术-6,标准菌株,Hsp65-PCR,rpoB-PCR,RFLP,测序,Hae,BstpI,Hae,MspI,BLAST,模拟酶切,注：先用两种基因进行酶切，进行指纹图谱分析，仍然无法鉴定出的进行测序，在NCBI数据库上进行比对。,分枝生物学鉴定技术IS6110-RLFP,病原检测、鉴定技术-7,结核分枝杆菌全基因组DNA pvuII 酶切产物,IS6110-RFLP分析内对照标准分子,结核分枝杆菌IS6110-RFLP结果,结核分枝杆菌聚类分析树状图,分枝生物学鉴定技术 Spoligotyping,病原检测、鉴定技术-5,结核分枝杆菌Spoligotypin
8、g指纹图,结核分枝杆菌Spoligotyping结果聚类树状图,MLVA15 clustering of a selection of MTB isolates from 12 provinces in China,Putative Beijing ancestor group,CAS group,Beijing family,分枝生物学鉴定技术 MLVA,病原检测、鉴定技术-5,分枝生物学鉴定技术 恒温PCR技术 荧光定量PCR技术 芯片技术 技术关键：标本前处理特异的DNA分子标识物,病原检测技术-5,常用病原检测、鉴定程序,多位点PCR,细胞免疫学检测技术 体液免疫学检测技术 技术关键：
9、特异抗原,免疫学检测技术,PPD皮试、ESAT-6 基于T细胞检测技术IFN-ELISPOTESAT6 and CFP10,细胞免疫学检测技术,检测体液中抗体：IgM、IgG间接酶联免疫技术、酶免疫斑点、 间接免疫荧光技术、胶体金 技术关键：特异抗原,体液免疫学检测技术,基于细菌培养的技术： 比例法、绝对浓度法金标准，费时、费力、效果不好 The BACTEC radiometric method速度稍快、费用昂贵,药物敏感性检测技术,基因检测技术 PCRDNA测序分析 Solid-phase hybridization techniques: LiPA strips showing different mutations,药物敏感性检测技术,采用基因测序（DNA sequencing）分析和反向斑点杂交技术（RDH）对分别对异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇四种一线抗结核药物的耐药相关基因进行了检测，共检测了1300余株临床菌株。,RDH技术检测利福平耐药基因结果,耐药菌株中, 91.16% (165/181) 检测到基因突变。RDH与DNA测序比较，敏感性和特异性分别为97.62%和97.73%，符合度为97.67%.,耐药性检测技术,荧光定量PCR技术 基因芯片技术 噬菌体技术,药物敏感性检测技术,Thank You for Your attention,
