1、Cell cycle control & Cancer,肿瘤是细胞周期调控机制破坏的疾病。,2001 Nobel Prize,Leland H. Hartwell 1970s “Checkpoint” Yeast genetics 100 CDC genes Start gene,Tim Hunt 1980s Cyclins Sea Urchins,Paul M. Nurse 1970s CDKs yeast,Leland Hartwell,哈特韦尔的贡献，一是发现了一系列控制细胞周期的重要基因；二是他为了解这些基因如何合作以控制细胞分裂提供了一个逻辑框架。哈特韦尔的细胞周期生物学研究使他赢得
2、了多项美国和国际科学奖。,Paul Nurse,20世纪70年代中期，纳斯使用了不同于哈特韦尔的另一种酵母作为模型生物体，纳斯在这种酵母中发现了一种在控制细胞分裂中具有关键功能的基因，这个基因能调节细胞周期的不同过程。1987年，纳斯从人体细胞中分离出了相应的基因，并命名为CDK1 （细胞周期蛋白依赖激酶）。纳斯的研究表明，CDK的激活作用依赖于可逆的磷酸化作用。,Tim Hunt,亨特在20世纪80年代初发现了第一个CYCLIN，在细胞周期中这些蛋白质周期性的变化。这些CYCLIN附在CDK分子上，调节CDK活性。CYCLIN最初是在海胆中发现的，后来，亨特发现其他物种中也含有CYCLIN，
3、并且对细胞发育也具有重要意义。,有关细胞周期的原创性发现（问题，模型，现象，工具）对细胞生长的所有方面都具有巨大的影响。细胞周期控制的缺陷会导致见于肿瘤细胞中的某种染色体改变。这些发现能让我们在今后很长的时间内创造治疗癌症的新方法。,细胞周期概述,细胞周期的概念（concept of cell cycle）：指 从一次细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂 结束所经历的整个过程。分为：物质积累期（间期或静止期）和细胞分裂期。,Interphase: G1: gap (G0: quiescent state during which cell cycle does not proceed) S: r
4、eplication of DNA and assembly of chromosomal proteins on daughter DNA molecules G2: gapM phase: mitosis (nuclear division) cytokinesis (cytoplasmic division),细胞周期时相组成：,细胞增殖是生命的基本特征,初生婴儿1012个细胞，成人1014个，约200种类型。 成人体内每秒钟有数百万新细胞产生，以补偿衰老和死亡的细胞。 一个大肠杆菌若按20分钟分裂一次，并保持这一速度，则两天即可超过地球的重量。,根据增殖状况，可将高等动物的细胞分为三类
5、： 连续分裂细胞，如表皮生发层、部分骨髓细胞。 休眠细胞，暂不分裂，但适当刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞，干细胞等。 不分裂细胞，不再分裂，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等。,细胞周期长短,同种细胞间周期时间长短相似或相同；不同种类细胞间，周期长短差别很大。S+G2+M 的时间变化较小，细胞周期时间长短差别在G1期，M期最短,约0.54.5小时。部分细胞的细胞周期没有G1、G2期。,细胞周期阻滞的几种结局,Mechanisms involved in cell cycle control:,Checkpoint regulation Differenti
6、al cyclin gene expression Protein degradation (ubiquitin pathway) CDK activities regulated by phosphorylation binding of cyclins,1. MPF(M phase promoting factor) , Cyclin ,CDK,1.1 MPF found,1.2 MPF components,Cyclin (B),CDK (cyclin dependent kinase ),1970s Rao等发现与M期细胞(Hela)融合的间期细胞染色体发生凝缩，称为早熟凝集染色体（P
7、CC）。 G1期PCC为单线状，因DNA未复制。 S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。 G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。 不同类的M期细胞也可诱导PCC产生，说明M期细胞具有促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子( MPF)。,1.1 MPF found,G1 phase fuse with M phase,s phase fuse with M phase,G2 phase fuse with M phase,Hartwell 1960s, Nurse 1970s 分别以芽殖酵母和裂殖酵母为材料，利用温度敏感突变株，发现许多与细胞分裂有关的基因( cdc)。如
8、： 裂殖酵母cdc2、 芽殖酵母cdc28突变型在限制温度下无法分裂； wee1突变型则提早分裂，cdc25突变型细胞体积增大而不分裂； cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行，weel和cdc25分别表现为抑制和促进cdc2的活性。,budding yeast,Fission yeast,Cdc 25 & Wee1 mutant,T. Hunt 1980s发现海胆的卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期振荡，命名为cyclin A和B，其mRNA能诱导蛙卵成熟。,1988年Lohka将非洲爪蟾的MPF纯化。经鉴定MPF由32KD和45KD两种蛋白组成，是一种丝氨酸
9、/苏氨酸激酶。进一步的研究发现MPF=cdc2+cyclin B,The core mechanism of cell cycle regulation,CDKs,Cyclins,CKIs,CAK,Wee1/CDC25,Degradation,1.2 细胞周期素(cyclin ) 特点：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导与CDK结合。 作用：激活和引导CDK作用于不同底物。 已知30余种，分为4类：G1型、G1/S型、S型、M型。,A2,Destroy box,Cyclin box,B1,PEST, G1 cyclin renewal,C,Dif
10、ferent Cyclin expressed in different cell cycle phase Bind with Different CDK,regulate CDK kinase activity,G1期，在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，释放转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A、CDK1和DHFR的基因。 G1-S期，cyclinE与CDK2结合，激活DNA复制。 G2-M期，cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1引起染色体凝缩、核膜解体等。,Experimental De
11、monstration that Cyclin D is Required for Passage Through the Restriction Point in the Mammalian Cell,Overexpression （Gene Amplification） 乳腺癌、胃癌、食道癌Chromosome reverse 甲状旁腺腺癌Chromosome rearrangement B淋巴细胞白血病Gene mutation (T286),Cyclin D,1.3 CDK： Cyclin depend kinase,cdc2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，故名细胞周期蛋白依赖性激
12、酶(CDK)。 cdc2又称CDK1，可将特定蛋白磷酸化，如： 将核纤肽磷酸化导致核纤层解体、核膜消失； 将H1磷酸化导致染色体的凝缩等。 在动物中已知7种CDK。均含PSTAIRE保守序列，与周期蛋白的结合有关。,1.4 CDK inhibitory proteins (CKI)对细胞周期起负调控作用，分为： Ink4: 抑制cdk4cyclin D1, cdk6cyclin D1。 Kip：抑制大多数CDK。其中P21cip1还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA结合，直接抑制DNA的合成。,CDKsOver-expression of CDK4 and CDK6 CKILower expr
13、ession or mutation (p16, Kip/cip)P21ciplCyclins / CDKs PCNACell Cycle velocity inhibition of DNA replication,2 CHECKPOINT,组成：感受器、信号传导通路、效应器。 主要检验点： G1/S检验点：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)。 S期检验点：DNA复制是否完成？ G2/M检验点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？ 中-后期检验点：纺锤体组装检验点。,Four checkpo
14、ints,2.1 The G1 /S Checkpoint,Environmental Growth factors- (from other cells), e g PDGF Density dependent inhibitionInternal DNA damage,G1 cyclin D(D1,D2,D3),E,A G1 CDK,CDK2,4,6 cyclin D+CDK4,6 cyclin E,A+CDK2 cyclin D(D1,D2,D3) is key factor for G1/S cyclin E is key factor for startup s-phase G1 p
15、hase cyclin degradation by Ubiquitin through PEST,Rb基因的异常主要表现为等位基因缺失和基因突变。除了视网膜母细胞瘤和骨肉瘤外，在许多种肿瘤中也检测到Rb基因的突变，包括肺癌（40%）, 膀胱癌（30%），前列腺癌（20%）以及乳腺癌，宫颈癌和某些类型的白血病。,2.2 S/G2/M,DNA replication checkpoint If DNA did not complete replication, s-phase could not change into G2 This G2checkpoint senses unreplicat
16、ed DNA, which generates a signal that leads to cell cycle arrest. CDC25 activity is low but Weel activity is high,MPF inactivate, G2 checkpoint :G2 checkpoint prevents the initiation of mitosis until DNA replication is completed Only the inhibition of G2 progression relieved, allowing the cell to in
17、itiate mitosis and distribute the completely replicated chromosomes to daughter cells.,2.3 M-phase regulation,MPF activate M phase checkpoint,MPF & the G2 Checkpoint,MPF- pushes cell past G2 checkpoint,Cdc2 Activates Cdc25 and Inhibits Wee1: Positive Feedback Loop A little Cdc2 goes a long way,Thr 1
18、61,Tyr14,15,This means Cdc25 Must also be regulated,Tyr 15 Inhibitory: Added byWee1 Removed by Cdc25,Thr 160 Activating: CDK adds after Cyclin binding,MPF induces multiple nuclear and cytoplasmic changes at the onset of M phase, both by activating other protein kinases and by phosphorylating protein
19、s such as condensins and the nuclear lamins.,So MPF gets us into mitosis, how do we get out? One can imagine many possibilities:,Activate Wee kinase and turn off MPF Inactivate Cdc25 phosphatase Activate a phosphatase that undoes the work of CDK Synthesize an inhibitor of MPF, a CKI It turns out all
20、 these possibilities are wrong. The solution lies in the behavior of CYCLIN,Cyclin Destruction Drives Mitotic Exit,APC and M-regulation,APC: Anaphase Promoting Complex M-phase to anaphase depend on rigid regulation APC1-8 APC regulate Cyclin B and other protein Ubiquitination Spindle assembly checkp
21、oint control APC activity,Anaphase Promoting Complex & the M Checkpoint,Mad2,Cdc20,2004年诺贝尔化学奖授予以色列科学家阿龙切哈诺沃、阿夫拉姆赫什科和美国科学家欧文罗斯，以表彰他们发现了泛素调节的蛋白质降解。其实他们的成果就是发现了一种蛋白质“死亡”的重要机理 。,死亡之吻,Protein degradation,Need not energy, only need enzyme,Need energy, certain time , certain position certain direction pro
22、tein degradation,一种被称为泛素的多肽在需要能量的蛋白质降解过程中扮演着重要角色。这种多肽由76个氨基酸组成，它最初是从小牛的胰脏中分离出来的。它就像标签一样，被贴上标签的蛋白质就会被运送到细胞内的“垃圾处理厂”，在那里被降解。,Ubiquitin: Proteins are usually tagged for selective destruction in proteolytic complexes called proteasomes by covalent attachment of ubiquitin, a small, compact, highly conser
23、ved protein.,Polyubiquitination of mitotic cyclins,Fortuitous Discovery of Cyclin B Ubiquitination,IP of 35S-Labeled Cyclin B:,Normal Exposure,Over Exposure,Cyclin B,Cyclin B-Ub Ladder,原来细胞中存在着E1、E2和E3三种酶，它们各有分工。E1负责激活泛素分子。泛素分子被激活后就被运送到E2上，E2负责把泛素分子绑在需要降解的蛋白质上。但E2并不认识指定的蛋白质，这就需要E3帮助。E3具有辨认指定蛋白质的功能。当
24、E2携带着泛素分子在E3的指引下接近指定蛋白质时，E2就把泛素分子绑在指定蛋白质上。这一过程不断重复，指定蛋白质上就被绑了一批泛素分子。,High Energy Thioester Bond, can be transferred from E1 to E2, E3, or substrate,Ubiquitin is Transferred via Thioester Bonds,Ubiquitination of Protein Substrates,E3 Enzymes: responsible for specificity and diversity of Ub system,Mit
25、otic Cyclins are Destroyed by Ubiquitin-Dependent Proteolysis,Current model for regulation of the eukaryotic cell cycle,Checkpoint and cell cycle regulation,细胞周期同步化,细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化 （一）自然同步化 1、多核体：如：粘菌、疟原虫。 2、某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。 3、增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发
26、芽，同步分裂。,人工同步化,1、选择同步化 1）有丝分裂选择法：M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。 优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。 缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%2%）。 2）细胞沉降分离法： M期细胞体积大，可用离心分离。 优点：可用于任何悬浮培养的细胞。 缺点：同步化程度较低。,2、诱导同步化 1）DNA合成阻断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成。常用TDR双阻断法： 在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TDR（Hela 2mol/L；CHO 7.5mol/L）。S期细胞被抑制，停在G1/S交界处。移去TDR，释放时间大于TS时，再次加入过量TDR。 优点：同步化程度高 缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。 2）中期阻断法 用秋水仙素等细胞分裂抑制剂将细胞阻断在中期。优点是无非均衡生长现象，缺点是可逆性较差。,
