1、第四章 细胞工程 Cell Engineering,主讲教师 魏琴 教授,主要讲授内容： 1 细胞工程概述 2 植物细胞工程 3 动物细胞工程 4 微生物细胞工程,本章要求： 理解细胞工程的概念； 掌握植物组织培养的基本原理和方法； 理解植物非试管快繁的基本原理和方法； 理解植物细胞培养、人工种子、细胞融合的基本原理和方法； 了解植物细胞工程的研究进展与应用前景； 理解单克隆抗体技术、细胞核移植与动物克隆、染色体转移、干细胞等研究的基本原理与方法； 了解动物细胞工程的研究进展与应用； 了解微生物细胞工程的基本原理； 了解微生物细胞工程的研究进展与应用。,1 细胞工程概述,作为生物工程重要分支的
2、细胞工程，近年来获得了令人瞩目的迅速发展。这不仅是由于它在理论上具有重要的意义，而且在工农业生产方面也具有广泛的应用前景。,1.1 细胞工程概念,细胞工程：在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程，即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，并通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术（教材P60）。 细胞工程：应用细胞学的方法，按照我们人类的需要和预定的设计，有目的、有计划地保存、改变和创造新细胞及其遗传物质，从而产生新的种或者品种的技术。 细胞工程：应用细胞生物学和分子生物学的方法，在细胞水平进行的遗传操作。,1 细胞工程概述,细胞工程：是指以细胞为基本单位进行培养、增殖（细胞培养组织
3、培养）或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品。它主要由两部分构成，其一是上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。另一个则是下游工程，是将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程。,1.1 细胞工程 概念,1.2 细胞工程研究的对象,细胞或其组成部分和构成的组织、器官等如染色体、细胞核、原生质体、整个细胞、受精卵、胚胎、组织或器官。,1 细胞工程概述,1.3 细胞工程研究主要内容,细胞与组织培养：细胞、组织和器官培养三层次 细胞融合：单克隆抗体 染色体工程：染色体的添加、消减、替换 胚胎工程：胚胎分割、胚胎融合、
4、核移植、体外受精、性别鉴定、胚胎冷冻 细胞遗传工程：克隆、转基因技术,1 细胞工程概述,1.4 细胞工程的优点,1.4.1 细胞工程开辟了基因重组的新途径，它不需要经过分离、提纯、剪切、拼接等基因操作只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中，就能够形成杂交细胞，因而提高了基因转移的效率。,1 细胞工程概述,1.4.2 细胞工程克服了常规杂交的局限性，使远缘杂交有了新的途径。它不仅可以在植物一植物之间，动物与动物之间，微生物与微生物之间进行远缘杂交，甚至可以在动物与植物、动物与微生物之间进行细胞融合，形成杂交物种。土豆番茄、山绵羊、大豆烟草、芹菜胡萝卜 。 1.4.3 用细胞工程的技术来改造和创造
5、新生物，比起用基因工程技术来稍为容易些 。,1.4 细胞工程 的优点,1.5 细胞工程与其他生物工程的关系,细胞工程与其他生物工程的关系,1 细胞工程概述,1.6 细胞工程的应用,细胞工程作为科学研究的一种手段，已经渗入到生物工程的各个方面，成为必不可少的配套技术。在农林、园艺和医学等领域中，细胞工程正在为人类做出巨大的贡献。,1 细胞工程概述,优质植物快速培育与繁殖 动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种 利用动植物细胞培育生产活性产物、药品 新型动植物品种的培育 供医学器官修复或移植的组织工程 转基因动植物的生物反应器工程 珍稀动植物资源的保存与保护 在遗传学发育学等领域的理论研究 在能源、环
6、境保护等领域的应用,1.6 细胞工程的应用,2 植物细胞工程,2.1 植物组织培养 2.2 植物细胞培养 2.3 植物非试管快繁 2.4 植物原生质体培养与融合 2.5 人工种子的研制 2.6 植物细胞工程研究进展（综述）,2.1 植物组织培养 （Plant tissue culture）,2.1.1 几个重要概念 2.1.2 对植物组织培养实验室的要求 2.1.3 植物组织培养的步骤 2.1.4 主要植物组织培养技术,2 植物细胞工程,2.1.1 几个重要概念,植物细胞全能性（Cell Totipotency）： 指任何具有完整的细胞核的植物细胞（不管性细胞还是体细胞），都拥有形成一个完整植
7、株所必需的全部遗传信息，在特定的环境下能进行表达，产生一个独立完整的个体。 满足两个条件:离体;给予适当的刺激经历两个过程:脱分化;再分化,2.1 植物组 织培养,脱分化 再分化 外植体 愈伤组织 生长点幼茎、根 小植株,植物组织培养：在 无菌条件下，将离体的植物器官（根尖、茎尖、叶、花、果实、种子等）、组织（花药、胚乳、皮层、髓组织等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎（成熟或未成熟的胚）、原生质体等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、丛生芽或长成新的完整的植株的一种实验技术。由于在试管内培养，且培养的是脱离植株母体的培养物，所以也叫“离体培养” （Culture
8、 in vitro）或“试管培养” （In test-tube culture） 。,2.1.1 几个重 要概念,外植体(Explant)：植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。 愈伤组织(Callus)：外植体产生的排列疏松而无规则且没有发生分化的薄壁细胞。 脱分化（dedifferentiation）：原来已经分化,并且具有一定功能的体细胞(或性细胞),丧失了原有的结构和功能,又重新恢复了分裂功能,就叫做植物细胞的脱分化。,2.1.1 几个重要概念,2.1. 2 对植物组织培养实验室的要求,化学实验室或培养基配制室 洗涤室或消煮室 菌室或接种室
9、培养室 观察与鉴定室 温室或苗圃 贮存室,接种室,培养室,2.1. 2 对植物组织培养实验室的要求,观察与鉴定室,大棚,2.1. 2 对植物组织培养实验室的要求,2.1.3 植物组织培养的步骤 (http:/ 培养基配制 2.1.3.2 灭菌 2.1.3.3 接种 2.1.3.4 培养 2.1.3.5 试管苗驯化移栽 2.1.3.6 试管苗增殖率的估算 2.1.3.7 快速繁殖工作的计划安排,2.1 植物组 织培养,2.1.3.1 培养基（Culture medium ）的配制,一个完善的培养基成分： 无机营养成分大量元素：浓度大于0.5毫摩尔/升；包括H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等元素
10、（配成母液 ）微量元素：其浓度小于0.5毫摩尔/升；微量元素包括Cu、Mo、Zn、Na、Mn、Co B和I等（配成母液 ）铁盐 采用硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠结合成螯合铁配置而成（配成母液 ）,2.1.3 植物组 织培养的步骤,有机营养成分：（配成母液 ） 碳水化合物：蔗糖和葡萄糖，白糖节约成本一般的使用浓度为2%4%。 植物生长调节物质（常称为激素）：配成母液 生长素：NAA、IAA、IBA、 2，4D；细胞分裂素：KT(激动素)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、ZT（玉米素）、2iP（2异戊烯腺嘌呤）、4PU、CPPU（吡效隆）和TDZ（噻重氮苯基脲）。其它：赤霉素（GA3 ）；脱落酸（ABA
11、）；多效唑 （PP333 ） 水：,一个完善的培养基成分,培养基的种类： 按培养基组成特点分类 第一类为含盐量高的培养基，如MS、LS、BL、ER。 第二类为硝酸钾含量高的培养基，如B5、N6、SH。 第三类是无机盐中等含量培养基，如H和Nitsch培养基。 第四类为低盐含量基本培养基，如White、WS和HE培养基。 按培养基的功能分类 脱分化培养基 初代培养基 分化培养基 壮苗培养基 生根培养基 继代培养基,.1.3.1 培养基 的配制,外植体,愈伤组织（脱分化培养基）,丛生芽（再分化培养基）,再生根（生根培养基）,再分化,脱分化,壮苗（壮苗培养基）,接种,2.1.3.1 培养基 的配制,
12、怎样选取最佳培养基方案 （例：MS+6BA0.5mg/L+NAA1mg/L+Su3%+Agar0.6%）对于某个待培养的目的植物来讲：查资料-预备性试验-观察培养物的反映-调整：单因子试验，多因子试验和正交设计-逐步添加和逐步排除 基本培养基的选择 激素的选择：激素种类、浓度、激素配比 糖的选择：糖的种类、浓度的选择 琼脂的选择：主要是浓度的选择 附加物的选择：香蕉汁、活性炭、椰子汁等, 培养基的配制方法（药品室进行） MS+6-BA0.5+NAA1+Su3%+Agar0.6% 500 mL水+母液： 激素或其他成分：如活性碳等 糖类：一般30g/L 琼脂 ：一般68g/L 加热溶化： pH值
13、调整： 定容： 分注、封口： 灭菌 ：,2.1.3.1 培养基 的配制,2.1.3.2 灭菌,湿热灭菌：培养基及布制品的灭菌几种排气的方法：时间与体积的关系：放气方法：,2.1.3 植物组织培养的步骤,灼烧灭菌：用于无菌操作的器械 95%的酒精 +酒精灯火焰上灼烧 接种器杀菌器：如图 过滤灭菌：不耐热的物质,2.1.3.2 灭菌,干热灭菌：玻璃器皿及耐热用具等 紫外线和熏蒸灭菌：空间灭菌所用（培养室、接种室等） 一些物体表面用药剂喷雾灭菌,2.1.3.2 灭菌,消毒剂表面灭菌：植物材料（超净工作台上，接种室）消毒剂因素材料采集的因素老嫩因素部位因素天气因素季节因素时间因素外植体消毒步骤,2.1
14、.3.2 灭菌,消毒剂因素,2.1.3.2 灭菌,外植体消毒步骤,材料自来水蒸馏水75%酒精3060 S 无菌水34次10%次氯酸钠或次氯酸钙饱和液或0.10.2%升汞 （吐温）515 min 无菌水洗58次。,2.1.3.2 灭菌,.1.3. 接种（接种室）,2.1.3 植物组织培养的步骤,2.1.3. 培养 Culture（培养室）,培养方法 固体培养法 液体培养法 培养步骤 初代培养 ：愈伤组织；原球茎；顶芽和腋芽的发育 ；不定芽的发育 ；体细胞胚状体的发生与发育 ；初代培养外植体的褐变 继代培养：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等 生根培养:,2.1.3 植物组织培养的步骤,
15、培养条件：环境培养条件：温度（Light) 、湿度（Humidity) 、光照光质（Light wave)、光强（Light intensity)、光周期（Light period) 化学环境条件 ：渗透压（Penetrating pressure) 、 、气体（Gas),1.3. 培养,2.1.3.5 试管苗驯化移栽,试管苗与大田苗在生理、形态等方面的差异 异养型 自养型 无菌 有菌 管理：保持小苗的水分供需平衡。 防止菌类滋生。 一定的温、光条件。 保持基质适当的通气性。,2.1.3 植物组织培养的步骤,2.1.3.6 试管苗增殖率的估算, 基本数据的统计 每一周期（从接种当天到再次可供接
16、种的当天）需要多少天 每一周期每一瓶能接种多少瓶 每瓶有多少苗, 基本数据的统计 每一周期（从接种当天到再次可供接种的当天）需要多少天 每一周期每一瓶能接种多少瓶 每瓶有多少苗,2.1.3 植物组织培养的步骤,计算出年增殖率的理论值年增殖率：Y；每周期增殖的倍数：X； 全年可增殖的周期数：n=365/每一周期的天数； Y=Xn,2.1.3.6 试管苗增殖率的估算,仙茅（石蒜科）,葡萄（葡萄科）,茶树（山茶科）,麻疯树（大戟科）,油樟（樟科）,生姜（姜科）,兰草（兰科）,芦荟,兰 草,麻疯树,移 栽,2.1.3.7 快速繁殖工作的计划安排,人工的配置安排 实验启动的时间安排 增殖瓶数的控制 污染
17、的估测,2.1.3 植物组织培养的步骤,2.1.4 植物主要的组织培养技术,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术 2.1.4.2 花药及花粉培养 2.1.4.3 植物胚胎培养,2.1 植物组 织培养,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,2.1.4 植物主要的 组织培养技术,意义 快速繁殖，保持优良品质 生产无毒苗，提高苗木品质 节约土地,快速繁殖：一片树叶能变一座森林 一年内可从一个兰花茎尖繁殖出400万株遗传性状均一的健康植株； 花叶芋：常规繁殖：几倍几十倍组培繁殖：几万数百万倍 月季、菊花、牡丹、山茶等。 脱毒花卉：去病毒后，植株生长势强，花朵变大，色泽鲜艳 ，抗逆能力提高，产花数量上升。预
18、计在21世纪，这一技术的应用将更为广泛。如：兰花、大丽花、水仙、天竺葵菊花等。 脱毒马铃薯：增产40-200%(2000-2500kg/亩)。 红薯：增产30%以上。 草莓：增产500-1000千克 /亩,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术, 植物脱毒技术为什么植物需要脱毒 ? 脱毒方式： 热处理脱毒病毒钝化(寄主植物很少或不会受到伤害)温汤浸渍处理：在50左右的温水中浸渍10分钟至数小时。缺点：易使材料受伤。 热空气处理：35-40，几十分钟，长可达数月温热治疗室（箱）内 。缺点：缺陷是并非能脱除所有病毒热处理需与其他方法配合应用才可获得良好的效果。,生长
19、点（约0.1-1MM区域）几乎不含或含病毒很少. 分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不 上细胞不断分裂和活跃的生长速度。,茎尖培养脱毒,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,其他途径脱毒 愈伤组织培养脱毒 仅有部分单个细胞含有病毒病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度或有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。缺陷植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株，并且一些作物的愈伤组织尚不能产生再生植株。 化学疗法脱毒 许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等）对离体组织和原生质体具有脱毒效果。,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,脱毒效果检测 抗血清(antiserum)鉴定：已知植物病毒
20、核蛋白（抗原）制备抗体；抗血清+未知的病毒植物可见的沉淀（试管） 酶联免疫吸收鉴定（ELISA）：已知植物病毒（抗原）+一抗（已制备）二抗（酶）酶的显色底物溶液 酶标仪检测 电子显微镜（electric microscope)检查法：直接观察病毒 的有无或种类 指示植物法(indicating plant) ：被鉴定植物 的汁液接种指示植物或嫁接接种法 （指示植物作为砧木，被鉴定植物作接穗 ）,指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。,2.1.4.1 植物脱毒与快繁技术,2.1.4.2 花药及花粉培养,概念与意义 花药培养：花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来
21、改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，产生再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。属器官培养还是细胞培养 ？ 花粉培养：花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。 优点：不受花药的药隔，药壁、花丝等体细胞的干扰；缺点是较比花粉培养难度大。属器官培养还是细胞培养 ？为何更多的要花药培养?(药壁提供营养) 共同的目的：花粉细胞单倍体(haploid)细胞单倍体植株（但不是最终目的但具应用潜力，为什么？）经染色体加倍正常结实二倍体植株。,2.1.4 植物主要的
22、 组织培养技术,2.1.4.2 花药及花粉培养,单倍体植物三个明显的特点： 体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器官明显减小； 雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。 单倍体的应用潜力：迅速获得纯合型材料，缩短育种年限 获得育种中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义 作为遗传工程受体更为有效（当代表达） 用作基础遗传研究的各个领域 加倍后的二倍体特点：属于真正的纯系。和常规多代自交纯化方法相比，可节省大量的时间和劳力。,2.1.4.2 花药及 花粉培养,2.1.4.2 花药及 花粉培养,花药培养的基本程序是： 外植体选择外植体
23、(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养,花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。 烟草、茄子 35 72小时 水稻 10 1014天 柑橘 3 510天 马铃薯 4 48小时 低温处理的作用：可以激发花粉母细胞产生两个相等核:一个营养核一个生 殖核； 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；激发花粉产生原胚； 促使细胞同步分裂。,2.1.4.2 花药及 花粉培养,花药培养中单倍体形成的途径 营养细胞发育途径: 生殖核退化,营养核发育 生殖细胞发育途径: 营养核退化，生殖核发育 营养细胞和生殖细胞同时发育的途径: 花粉均等分裂途径:,2.1.4.2 花药及 花粉培养,
24、形成胚状体或愈伤组织,花粉及小孢子培养 花粉培养的基本程序是： 取材时期的确定外植体(花蕾)预处理外植体消毒花粉或小孢子的分离接种培养 取材时期的确定 四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚期三核期 预处理有利于改变正常的发育途径，而且还可以促进花粉植株的形成 花粉或小孢子的分离: 花药小烧杯(有基本培养基)挤压花药(注射器内管) 花粉释放过滤(尼龙筛)低速离心（100-160r/min)吸管吸掉碎片加入新鲜培养基连续进行两次过滤，到每毫升含103-104个花粉/mL 培养方法 花药看护培养 花粉悬浮培养（微室培养）,2.1.4.2 花药及 花粉培养,单倍体植株的鉴定与二倍化 鉴定方法：形态学鉴
25、定 染色体分析 单倍体植株的二倍化：继代加倍 创伤法加倍 秋水仙素处理加倍,2.1.4.2 花药及 花粉培养,2.1.4.3 植物胚胎培养 植物胚胎培养包括胚培养、 胚珠培养、子房培养、 胚乳培养。 植物胚培养(embryo culture of plants) 克服杂交育种中杂种胚的 早期夭折 胚培养包括成熟胚 (mature embryo)培养； 幼胚(immature embryo)培养,幼胚培养中，常见的生长方式有三种： (1)、胚性发育(embryonal development) 幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再
26、按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。 (2)、早熟萌发(early mature sprouting) 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。 (3)、愈伤组织(callus) 在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。,2.1.4.3 植物胚胎培养,子房
27、培养 子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。 材料的选择品种间的差异胚囊发育时期与花粉发育时期的相关性（大麦）花粉发育时期 胚囊发育时期 单核中期 大孢子四分体 单核靠边期 单核至四核胚囊 二核花粉期 八核胚囊 三核花粉期 成熟胚囊,2.1.4.3 植物胚胎培养,胚胎培养中单倍体的来源和发育途径由助细胞或胚囊的无配子生殖产生单倍体卵细胞、助细胞、反助细胞均可发育产生单倍体非正常发育的大孢子四分体产生单倍体,2.1.4.3 植物胚胎培养,胚乳培养 胚乳细胞的全能性？被子植物与裸子植物胚乳（三倍体或单倍体？） （在离体培养条件下，胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样，具有全能性而再生植株。） 大多数
28、被子植物的胚乳是三倍体，能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实；通过胚乳培养技术，探索改良农、林及园艺植物三倍体育种技术的可能性。 到目前为止，已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、叶等或得到愈伤组织。,2.1.4.3 植物胚胎培养,裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为配子体的一部分，由大孢子直接分裂发育而成，因此它是单倍体组织。 在被子植物中胚乳是双受精的产物，在倍性上属于三倍体，事实上我们培养胚乳的首要目的也是为了直接获得三倍体植株。,2
29、.1.4.3 植物胚胎培养,2.2.1 细胞悬浮培养 2.2.2 固定化细胞培养 2.2.3 植物细胞大规模培养与有用物质生产,2.2 植物细胞培养(suspension culture),2 植物细胞工程,2.2.1 细胞悬浮培养 2.2.1.1 细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。植物细胞培养中常用方法。怎样获得单个游离细胞?（酶解）怎样获得小细胞团？（愈伤组织分割；机械法；单细胞聚集） 2.2.1.2 基本过程：外植体（幼胚、胚轴、子叶等）培养基愈伤组织（松散性好、增殖快、再生能力强） 或酶解物震荡培养大量植物细胞次生代谢产物,2.2 植物细胞培养(
30、suspension culture),2.2.1.3 悬浮培养三个优点： 改善营养供应：增加培养细胞与培养液的接触面； 避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害； 可以适当改善气体的交换。,2.2.1 细胞悬浮培养,2.2.1.4 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： 悬浮培养物分散性良好：细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 均一性好：细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速：悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。,2.
31、2.1 细胞悬浮培养,2.2.1.5植物悬浮培养系统：封闭式培养系统组成、操作、有缺点（半连续培养和连续培养）实例（银杏、冬青、蔷薇等）,2.2.1 细胞悬浮培养,机械搅拌式培养系统 机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置； 为便于取样观察，一般还设计有取样口。,优点：很高的 溶氧系数，适于耐剪切力强的植物细胞培养
32、。 缺点：剪切力大 实例：烟草细胞、水母雪莲细胞等,气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。,2.2.1 细胞悬浮培养,2.2.1.6 植物悬浮培养（小细胞团）的目的（或应用）： 种质保存固体培养基上继代培养 得到大量植物细胞产物基上进行，如人参干细胞粉；紫草细胞消炎药物 得到次生代谢产物液体培养(主要应用) 生物转化利用酶系的作用将第五转化为所需的产物,2.2.1 细胞悬浮培养,2.2.2 固定化细胞培养 2.2.2.1固定化细胞：指固定在载体上，在一定的空间范围内
33、进行生命活动的细胞。 优点：稳定性好，产物易分离，利于连续化生产 缺点：只适合分泌到细胞外的次生代谢物的生产 细胞生长分裂旺盛时，次生代谢物产量低。采用固相培养，将细胞培养在惰性基质中，细胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量.,2.2 植物细胞培养(suspension culture),2.2.2.2 植物细胞固定化的方法 吸附法:利用各种固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。 吸附材料：多孔陶瓷、多孔塑料、多孔玻璃等。 实例：多孔泡沫放入辣椒细胞的培养液中；,2.2.2 固定化细胞培养, 包埋法 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等； 附着式固定
34、化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。,2.2.2.2 植物细胞固定化的方法,2.2.2.3 固定化植物细胞的特点（与植物细胞悬浮培养对比） 减轻剪切力和其它外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率和稳定性 （载体的保护作用） 细胞不易聚集成团（细胞被束缚在一定的范围） 更换培养液容易 缩短生产周期（可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产）。 固定化细胞易与培养液分离 细胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。,2.2.2 固定化细胞培养,消除代谢产物积累对细胞生长的抑制作用 (培养周期延迟期（细胞很少分裂或刚刚开始分裂），直线生长期（对数生长期，细胞生长
35、分裂旺盛时，次生代谢物产量低，细胞数目迅速增长，生长速率保持不变生长期，细胞数增长最快，而细胞的干重和蛋白质含量增长较慢）， 减缓期（细胞数目的增长速度减缓）， 静止期（细胞分裂停止，细胞数目恒定。培养基中营养耗尽，必须进行继代培养，进入静止期之前，细胞数增长减慢，而细胞鲜重和干重增长超过了细胞数的增长，并一直持续到静止期）,2.2.2 固定化细胞培养,2.2.2.4 固定化植物细胞培养系统 平床培养系统 立体培养系统,2.2.2 固定化细胞培养,2.2.2.5 固定化植物细胞培养的应用,2.2.2 固定化细胞培养,扫描图：P115（细胞培养书）,2.2.2 固定化细胞培养,2.2.3 植物细
36、胞大规模培养与有用物质生产 利用培养细胞生产有用物质（次生代谢物质）的原理细胞的全能性：培养细胞具有该物种的药物生物合成（次生代谢物质）的全能性。每个植物活细胞都具有该物种的新陈代谢、应激性和自体复制等生命基本属性，在合适的离体培养条件下，可以展现这些特征属性。 。植物次生代谢产物是指植物中一大类非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。,2.2.3.1 一般程序 选材 培养器官、组织的选择：取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。 细胞生长状态的选择：自然条件下，一般植物生长不活跃的部分，
37、如老叶、果实和种子，倾向于积累次生代谢物，而分生组织等快速生长的部分，次生代谢物的含量低。 植物离体培养下，一般脱分化的细胞生长旺盛，很难积累次生物质。当细胞接近于衰老时，才趋向于积累次生代谢物质。,2.2.3 植物细胞大规模培养与有用物质生产,细胞株系建立 建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养） 合成能力高的细胞株系的筛选与更新：筛选高产的细胞株系是提高生产率、降低生产成本的重要因素。对细胞培养的选择有两个基本要求： （1）有用物质的合成积累能力强 （2）生长速度快,2.2.3.1 一般程序,大量培养 将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为细胞工厂化培养的生产“种子”，进行大量培养。 产品提取与纯化
38、 从植物细胞培养物中提取和纯化有的产品。,2.2.3.1 一般程序,2.2.3.2 培养方法二步培养法 细胞生长与次生物质的产生对培养基与培养条件的要求不同，因而在细胞工厂化培养中采用二步培养方法，既使细胞生长快，又使次生物质代谢多。,第一步，促进细胞分裂，解决生物量生产问题； 第二步，促进次生代谢物合成，解决次生物质的积累问题。在细胞指数生长停止期前后才更换培养基，有利于次生物质的积累。（一部分细胞用于提取物质，另一部分用于继续培养，进行下一个细胞周期）,2.2.3.2 培养方法 二步培养法,2.2.3.3 提高有用物质生产效率的技术因素 细胞株系生物合成能力以特异的器官为材料筛选生物合成能
39、力强的细胞株,Wayner等用柠檬叶、鸡眼藤的培养物，经过筛选细胞株系，其次生代谢物是该植物完整植株的10倍。Zenk从长春花的培养物中，筛选出高产细胞株系，其生产根碱和阿玛碱的总量，比亲本植物高1.5倍，是亲本植物根含量的5倍。,培养基中添加前体 前体：有用次生代谢物的前驱物。 烟草愈伤组织培养中，将前体物质烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。 （前体物质的加入时间非常重要，应注意。） 培养基中生长调节剂（激素）的作用 植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化与再分化，而且能影响次生代谢物质的产生。如烟草愈伤组织培养中，培养基中添加吲哚乙酸（IAA），能合成烟碱，而在含有2,4-D的培养基上，烟碱合成
40、受阻。,2.2.3.3 提高有用物质生产效率的技术因素,培养条件的影响 光照、温度等影响次生代谢 在胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。,2.2.3.3 提高有用物质生产效率的技术因素,2.2.3.4 细胞大规模培养与有用物质的生产,生物碱 类黄酮类 萜类 菑体类 蛋白质和多肽类,生物碱 苦参的愈伤组织苦参碱降血压、扩张血管，治冠心病。 乌头愈伤组织乌头碱驱寒、散风、通经、止痛 长春花愈伤组织长春花碱治白血病高效药 喜树叶愈伤组织喜树碱抗肿瘤 黄连愈伤组织小蘖碱 （黄连素的主要成分）抗菌消炎, 萜类物质 利用人参愈伤组织培养生产皂苷已进
41、入工厂化生产。紫杉醇 醌类物质 利用紫草、决明等愈伤组织培养，生产具有抗细菌活性的醌类物质。 蛋白质 商品胰岛素多数从动物的胰脏提取，但价格昂贵。从苦瓜离体培养物种可提取胰岛素。 SOD、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶 类黄酮类 ：银杏黄酮、花青素、查尔酮 菑体类：VD、激素、强心苷,2.2.3.4 若干有用物质的生产,2.2.3.5 存在问题 植物细胞培养生产有用物质尽管有种种优点，但与微生物培养比还存在许多问题。 生长速度较慢，通常完成一次生产周期需45周才能完成；而微生物的工业发酵只需几天就可完成发酵全过程。,植物细胞培养生产次生代谢物的总量一般比植物本身低，这主要是由于大多数离体培养细胞不能合
42、成和积累所期望的化合物，当然也有些细胞株系产量高，这与微生物大不相同。,2.2.3.5 存在问题,生产技术上还存在一些问题。培养过程需要复杂的培养基及附加物，且易受细菌、真菌的污染；次生物的产量不甚稳定，成本较高等。,2.2.3.5 存在问题,2.3 植物非试管克隆技术,Technique of Efficient & Rapid Non-tube Plant Cloning http:/ 该技术是基于一个集温度、湿度、光照、二氧化碳浓度、蒸发系数、营养液浓度等为一体的传感器（智能叶片），通过计算机控制系统为植物的离体材料创造最佳的生根环境，并采用无土栽培及技术，实现苗木快速繁殖的一项高新技术
43、。,2 植物细胞工程,基本流程： 插床设置（苗床或营养袋）铺设基质插穗来源插穗规格（硬枝或绿枝） 扦插专用药剂处理（药剂型号） 扦插生产周期安排插后智能叶片管理(T、R、光照、杀菌、补充营养液) 育苗生根成活炼苗移栽定植大田或苗圃继续培养,非试管繁殖与组培的区别,非试管繁殖与传统营养繁殖的区别,智能叶片,智能模拟计算机,豆腐菜（马鞭草科）,桂花（木樨科）,葡萄（葡萄科）,松（松科）,2.4 植物原生质体制备与融合,几个概念： 什么是原生质体：？ 原生质体制备：将旺盛生长的植物细胞起来，悬浮在含渗透压稳定剂的高渗缓冲液中，加入适量的细胞壁水解酶，在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。除去细胞壁
44、碎片、未作用的细胞等，即得。 原生质体培养是将植物原生质体在一定条件下培养，经过细胞壁再生而形成 细胞，再分裂成细胞团的过程。,2 植物细胞工程,植物原生质体的特点（与植物细胞比）： 仍然具细胞全能性：？（学生总结） 吸收能力增强利于.? （学生总结） 分泌能力增强利于.? （学生总结） 稳定性较差不利于.? （学生总结）解决？,原生质体融合，即体细胞杂交。用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。 原生质体制备和培养是原生质体融合的先导技术,2.4.1 基本程序：原生质体制备（材料的选择、酶
45、的使用、渗透压的调控、原生质体的收集与纯化、原生质体活力的测定 ）原生质体融合（自发融合、诱导融合）杂种细胞选择杂种细胞培养由杂种组织再生植株杂种或胞质杂种植株的鉴定,2.4 植物原生质体制备与融合,电融合法：不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。 PEG诱导融合法：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。,杂种细胞选择,设计一个选择程序，使在某种条件下只有杂种细胞生长，而任一亲本却不能在此条件下生长，或生长速度缓慢、或中途夭折 借助于精巧的显微操作技术将融合体和杂种细胞直接挑选出来进行单独培
46、养 杂种细胞的选择系统 1、外观选择 互补选择 荧光标记选择 2体细胞杂种的鉴定,2.4 植物原生质体 制备与融合,鉴定： 通过杂种植株和亲本植株的形态学特征来鉴定 细胞学鉴定：杂种和亲本的核型分析 生化鉴定：杂种和亲本的同工酶谱分析 分子生物学的方法： RFLP鉴定、RAPD标记鉴定 杂种植株和亲本植株的其它特性,2.4 植物原生质体 制备与融合,2.4.2 细胞融合的意义 克服远缘杂交不亲和性，为广泛重组遗传物质开辟新途径(如野生种的有效利用等） 可缩短育种年限 利用细胞融合技术转移细胞器（如叶绿体、线粒体等）及目的基因等。,2.4 植物原生质体 制备与融合,2. 人工种子（artific
47、ial seeds）的研制,2.1 合成种子（synthetic seeds）或体细胞种子（somatic seeds）任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均可称之为人工种子。,2 植物细胞工程,2.5.2 优点： 2.5.2.1 在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应； 2.5.2.2 可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有重要的实用意义； ,2. 人工种子的研制,2.5.2.3 对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍
48、体、非整倍体、基因工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用； 2.5.2.4 与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险； 2.5.2.5 与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。,2. 人工种子的研制,2.5.3 人工种子包被 繁殖体的预处理（脱水干燥和强制休眠）繁殖体的包埋(海藻酸钠作包埋介质) 贮存与萌发,2. 人工种子的研制,2.5.4 人工种子的发展和应用前景 2.5.4.1 微器官人工种子可能最先用于无性繁殖植物 2.5.4.2 人工种子可用于天然种子繁殖后代群体变异大的植物 2.5.4.3 以体细胞胚为繁殖体应用的可能性及需要注意的问题,
