1、实验六 血清ALT活性测定,一、何谓ALT？,谷丙转氨酶 （glutamic pyruvic transaminase，GPT）丙氨酸氨基转移酶 （alanine aminotransferase，ALT）,复习：,反应式,大多数氨基酸可参与转氨基作用，但赖氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸除外。,二、ALT催化的化学反应:,三、ALT的分布:,主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等，血清中的含量很低。病变时，细胞受损，血清ALT含量升高。,四、ALT测定的临床意义：,作为（肝脏）疾病诊断和预后判断的指标之一。,五、测定血清ALT的方法：,King法（金氏法）Reitman法（赖氏法）Mohun法（穆氏法）,1
2、981年全国生化检验方法学讨论会确定用赖氏法（改良）作为临床首选，单位为：卡门氏单位 。,实验六 血清ALT活性测定 -改良赖氏法,一、实验性质：分析性,二、目的及要求1、掌握ALT测定的原理及临床意义2、熟习测定的操作方法。,在一定反应条件下 ( pH7.4，37 ) , 作用 30 min：,三、原理 ：,-酮戊二酸,丙酮酸,+ 2,4 二硝基苯肼,两者在 碱性条件下 呈 红棕色 ，等摩尔浓度条件下，丙酮酸 OD 值 大 a-酮戊二酸 3倍。,四、试剂：省略,各管加入0.4 M NaOH 5.0 ml，室温放置10 min； 在波长505 nm 处，以蒸馏水校正零点，读取各管吸光 度；根据
3、 (AU-AB) 标准曲线，得到酶活性的卡门氏单位数。,1、将 基质缓冲液 和 血清 在 37 水浴箱预温5min。,五、操作步骤：,各管加 2,4-二硝基苯肼溶液0.5 ml，混匀，37水浴 20min； 各管加 0.4 mol/L NaOH溶液5.0 ml，混匀，室温放置10min。,波长505 nm处比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度； 各管读数均减去0号管吸光度，所得差值与对应的卡门氏酶活性单位作图即成标准曲线。,六、结果分析：,正常参考值：525卡门氏单位,七、注意事项：1一般血清标本内源性酮酸很少，血 清对照管吸光度读数接近试剂空白管 ( 以 0.1ml蒸馏水或生理盐水代替血清，
4、其它和对 照管同样操作)，所以大批标本测定时，一般 不需要每一标本都作血清对照管，以试剂空 白管代替即可。但建议对超过正常的标本进 行复查，复查时每份标本应作对照管。,2严重脂血症或黄疸、溶血的血清可 能会引起测定管吸光度增加，因此检测此类 标本时，应作血清对照管。,3赖氏法原法标准曲线只到97卡门 氏单位，直线关系很好。超过此活力的标本 应稀释后再测，临床上应用甚为不便，故卫 生部临检中心推荐法建议标准曲线延长到 150卡门氏单位，实际已不完全成直线了， 只能大致反应酶活性的大小、当血清标本酶 活性超过150卡门氏单位时，应将血清用生理盐水或缓冲液稀释5倍后再进 行测定。,4加入2,4-二硝基苯肼溶液后需充分振荡混匀，否则会影响重复性；加氢氧化钠溶液方法要一致，不同方法也会导致吸光度读数的差异。5基质缓冲液和 2,4-二硝基苯肼溶液配制必须准确，每次测定时空白管吸光度上下波动不应超过0.015，如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的问题。,八、实验报告：,九、思考题：,1、实验目的及要求：,2、实验原理：,3、材料与方法：只写自己所完成的操作,4、实验结果：原始结果、计算结果、标准曲线,5、体会：结合具体情况,
