1、第十七章 流式细胞仪分析技术及应用,流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。,流式细胞仪常检测的细胞特性,采用激光作为激发光源， 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，,一、工作原理,（1） 液流系统（2） 光学系统（3） 数据处理系统,1.流式细胞仪的基本结构：,由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流,（1）液流系统,鞘液：辅助样本
2、流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。,液流系统示意图,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）,（2）光学系统,光学系统示意图,主要由计算机及其软件组成,（3）数据处理系统,基本工作原理,基本过程,流式细胞仪与显微镜的区别,细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立
3、体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。,二、散射光的测定,前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。,前向散射光示意图,侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。,侧向散射光示意图,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分
4、析表面分子。,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,荧光染料的特性,激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION),荧光补偿,通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。,四、细胞分选原理,压电晶体,产生机械振动,不充电,充电,（一）分选基本原理,参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术,第二节 数据的显示与分析,FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少,一、
5、 参数,单参数直方图 双参数直方图:点图二维等高图假三维等高图 三参数直方图 多参数分析,直分析方图,设门分析:REGION和GATE设置,二、数据显示方式,由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（一）单参数直方图,单参数直方图,1.双参数直方图点图,双参数直方图点图,多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。,（四）流式细胞仪的多参数分析,Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现
6、这群细胞的分布情况。,根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,三、设门分析技术,A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞,A、B、C均为任意门,线性门,Region设置: 区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。,D1 CD4+/CD3- D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3- D4 CD4- /CD3+,如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。,样本制备 标记染色 液相芯片技术 质量控制,第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求,外周血淋巴细胞样品的
7、制备分离单个核细胞培养细胞的样品制备蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤,一、免疫检测样品制备,新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）,适用条件: 有较高的量子产额和消光系数 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性,二、常用的荧光染料与标记染色,激光,细胞悬液,异硫氰酸荧光素,得州红,能量传递复合染料,藻胆蛋白类,（一）几种常见的荧光染料,常用的几类荧光染料,用化学法
8、将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。,能量传递复合染料,488nm,575nm,670nm 红色荧光,花青苷5,藻红蛋白,能量传递复合染料机制,第四节 在免疫学检验中的应用,T淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T) B淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体 NK细胞分析NK(CD3-C
9、D16+CD56+),一、淋巴细胞及其亚群的分析,细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定,二、淋巴细胞功能分析,三、淋巴造血系统及白血病免疫分型,对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变,CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例,MDR(+)表示对化疗药物耐药,四、肿瘤耐药基因分析,五、AIDS病检测中的应用,HLA-B27可出现在58%97%的强直性脊椎炎(As) 患者,六、自身免疫病相关HLA抗原分析,FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。,七、移植免疫中的应用,
