1、Edit your company slogan,学习情境二 霉菌发酵制药,发 酵 制 药,Edit your company slogan,子学习情境2.1 青霉素发酵,任务一 抗生素概述,,第一节 抗生素剂量表示法,效价单位 ：每毫升或每豪克中所含某种抗生素有效成分的多少 单位：u/mg 或u/ml,,一、稀释单位将抗生素配成溶液，逐步稀释，抑制某标准菌株的最高稀释度(即最小剂量)作为效价单位。二、重量单位以抗生素有效成分（生理活性成分）的重量作为抗生素的单位。,,第二节 抗生素的分类,一、根据生物来源 (一）放线菌产生的抗生素 (二）真菌产生的抗生素 (三）细菌产生的抗生素 (四）其他生
2、物产生的抗生素,,二、根据作用对象(一)抗G （二）抗 （三）广谱抗生素 （四）抗真菌抗生素 （五）抗肿瘤抗生素 （六）抗病毒抗生素 （七）抗结核分支杆菌霉素,,三、根据化学结构 （一）内酰胺类抗生素 （二）四环类抗生素（三）氨基糖苷类抗生素 （四）大环内酯类抗生素 （五）多烯大环类抗生素 （六）多肽类抗生素 （七）蒽环类抗生素 （八）其他类,,四、根据作用机制（一）抑制细胞壁合成 （二）影响细胞膜功能 （三）抑制和干扰蛋白质合成 （四）抑制核酸合成 （五）抑制细菌生物能作用,,第三节 抗生素的用途,一、抗生素在医疗上的用途 （一）控制细菌感染 （二）治疗真菌感染 （三）抗肿瘤 （四）抗病毒,
3、,二、在农牧业上的应用 （一）防治植物病害 （二）促进或抑制植物生长 （三）畜牧业的应用 三、食品保藏 四、工业上的应用,,Edit your company slogan,任务二 抗生素工业生产概论,第一节 抗生素的生产方法,一、微生物发酵法 利用特定的微生物，在一定条件下（培养基、温度、通气、搅拌）使之生长繁殖，并代谢产生抗生素。用适当的方法从发酵液中提取出来，并加以精制、最后获得抗生素成品。 大多数抗生素用此法制备。 特点：成本低、周期长、波动大,,二、化学合成法 某些化学结构明确，结构比较简单的，可用化学方法合成。 三、半合成法 发酵出来的抗生素经化学方法改造，以获得性能更优良的抗生素
4、。,,第二节 发酵法生产抗生素的工艺过程,工艺过程：菌种 孢子制备 种子制备 发酵发酵液的预处理及过滤提取及精制 成品检验 成品包装出厂检验,,一、 生产菌种 合理保藏。一般保存在沙土管或冷冻于干燥管中。一般使用期为年，不断纯化淘汰变异菌种。 二、 孢子制备 将保藏的菌种无菌操作接种到斜面固体培养基中，在一定温度下培养数天。,,三、 种子制备 目的：使孢子发芽繁殖，获得足够数量的菌丝体，用于发酵。摇瓶培养种子罐培养。,,四、 发酵接种量一般在 通气（一般在） 搅拌（搅拌功率在千瓦） 温度（视品种而定，一般罐压（一般为）消泡（加消泡剂） 补料发酵周期（大多为天）,,五、 发酵液的预处理和过滤 （
5、一）预处理 目的：沉淀发酵液中的和杂质，以增加过滤速度。 （二）过滤 目的：除去菌丝体,,六、 提取和精制 （一）提取 目的：初步纯化和浓缩。 方法：吸附法、沉淀法、溶媒萃取法、离子交换法。 （二）精制 目的：进一步提纯并制成产品 方法：吸附、沉淀、溶媒萃取法、离子交换、结晶、重结晶、凝胶层析。,,七、 成品检验 性状及鉴别试验、安全试验、降压试验、热原试验、无菌试验、酸碱度测定、效价测定、水分测定、混浊度测定、色泽颗粒细度测定。 八、 成品分包装,,第三节 抗生素工业生产特点,一、 与一般发酵工业相比 （一）菌体生长与产物的形成不平行 （二）理论产量难以用物料平衡计算 （三）生产稳定性差,,
6、二、 与一般制药工业相比（一）染菌问题（二）粮耗问题（三）稳定性问题,,Edit your company slogan,任务三 青霉素的生产, 青霉素的结构及理化性质,一、天然存在的青霉素 青霉素是一族化合物的总称。,分子式： R为侧链，根据R基不同 青霉素G C6H5CH2- 青霉素X HOC6H4CH2- 青霉素F CH3CH2CH=CHCH2- 青霉素K CH3(CH2)6- 双氢青霉素F CH3(CH2)4- 青霉素V C6H5OCH2-,,二、青霉素的理化性质 （一）稳定性干燥纯净的青霉素盐很稳定，有效期都在三年以上，并且对热稳定，如结晶青霉素钾盐在150OC加热1.5小时效价不降
7、低。青霉素水溶液PH=5-7较稳定。最稳定的PH为6-6.5。 （二）溶解度 青霉素本身是一种游离酸，能与碱金属或碱土金属及有机氨类结合成盐类。青霉素游离酸易溶液于醇类、酮类、醚类和酯类，但在水溶液中溶解度很小；青霉素钾、钠盐则易溶于水和甲醇、微溶于乙醇、丙醇、丙酮、乙醚、氯仿，在醋酸丁酯或戊酯中难溶或不溶。如果有机溶剂中含有少量水分时，则青霉素G碱金属盐在溶剂中的溶解度就大大增加。 （三）降解反应,,, 青霉素产生菌的培养,一、青霉素产生菌的培养 （一）菌体的生长发育 分生孢子的期； 菌丝繁殖，原生质嗜碱性很强，有类脂肪小颗粒产生为期； 原生质嗜碱性仍很强，形成脂肪粒，积累贮藏物为期； 原生
8、质嗜碱性很弱，脂肪粒减少，形成中、小空泡为期； 脂肪粒消失，形成大空泡为期； 细胞内看不到颗粒，并有个别自溶细胞出现为期。其中期称为菌丝生长期，菌丝的浓度增加很多，但产生的青霉素较少，处于该时期的菌丝体适用于做发酵种子。期是青霉素分泌期，此时菌丝体生长缓慢，并大量生产青霉素。,, 发酵工艺控制,一、青霉素的发酵工艺过程 （一）工艺流程,,（二）工艺要点 1、培养基 碳源：葡萄糖母液和工业用葡萄糖 氮源：玉米浆、花生饼粉、麸质粉、玉米胚牙粉、尿素 前体：苯乙酸、苯乙酰胺作为前体，具有毒性，任何时候浓度不能大于0.1% 无机盐：S和P Ca Mg K 钾 30% 钙 20% 镁41% 铁离子 铁离
9、子对细胞具有毒害作用,,（三）培养条件控制 菌丝生长繁殖期：糖及含氮物质被迅速利用球状菌：菌丝发育为球状，菌体浓度迅速增加丝状菌：菌丝分支旺盛，菌丝浓度迅速增加 青霉素分泌期：菌丝生长趋势减弱，需添加G、花生饼粉、尿素。青霉素分泌旺盛球：PH6.6-6.9 球体不可太松，也不可太紧丝：PH6.2-6.4 脂肪粒消失，中小型空胞 菌丝自溶期：菌体衰老走向自溶PH上升青霉素 分泌下跌球：球体破裂丝：大型空胞增加并逐渐扩大自溶,,1.加糖控制 丝：残糖控制在0.6%左右，PH上升以后开始加糖。加糖控制：0-72小时 0.6-0.8% 72小时放罐 0.8-1.0% 加糖率每小时0.07-0.15%
10、每两小时加一次 球：当Ph高于6.5，约20之后开始加糖，根据PH高低酌情。 2.补料及添加前体 丝：接种后8-12小时，发酵液浓度40%左右开始补料发酵单位上升至2500U/ml开始补前体，每4小时 补一次使苯乙酰胺浓度为0.05-0.08% 球：因发酵基础培养基中没有前体，在10小时左右开始加入尿素、氨水和苯醋酸的混合料，每3小时加一次,,3.PH控制 主要通过加G控制PH 丝: PH6.2-6.4 球：PH6.7-7.0 4.温度控制 青霉菌最适生长温度高于最适分泌温度 丝和球都是变温培养，且前期罐温高于后期 丝 球 种子罐温 25 28 发酵罐温 26-24-23-22 26-25-2
11、4,,5.通气与搅拌 通气比为1：1.1-0.8（V/V/M） 丝： 种子罐转速发酵罐转速 球： 种子罐转速发酵罐转速 6.泡沫与消沫 过去：天然油脂如豆油、玉米油 现在：GPE PAGE,, 发酵液的预处理和过滤 一、预处理：青霉素发酵液过滤宜采用鼓式真空过滤机。因为青霉素在低温时比较稳定，同时细菌繁殖也较慢，可避免青霉素迅速被破坏，所以发酵液放罐后，一般要先冷却再过滤。过滤后的滤液需经酸处理除蛋白质，同时加入少量PPB。由于发酵液中含有过剩的碳酸钙，在酸化除蛋白质时会有部分溶解，使Ca2+呈游离状态，在酸化萃取时，遇大量SO42-形成CaSO4沉淀。因此，预处理除蛋白质时pH值适当高些。,
12、,二、过滤发酵液放罐后需冷却至10后，经鼓式真空过滤机过滤。从鼓式真空过滤机得到青霉素滤液pH在6.277.2，蛋白质含量一般在0.05%0.2%。这些蛋白质的存在对后面提取有很大影响，必须加以除去。除去蛋白质通常采用10%硫酸调节pH4.55.0，加入0.05%（W/V）左右的溴代十五烷吡啶（PPB）的方法，同时再加入0.7%硅藻土作助滤剂，再通过板框过滤机过滤。经过第二次过滤的滤液一般澄清透明，可进行萃取。,, 青霉素提炼工艺,,萃取pH：1.82.2 反萃取pH6.87.4 生产上一般将发酵滤液酸化至pH等于2.0，加1/3体积的醋酸丁酯（简称BA）混合后以卧式离心机（POD机）分离得一
13、次BA萃取液，然后以NaHCO3 在pH为6.87.4条件下将青霉素从BA中萃取到缓冲液中，再用10% H2SO4调节pH等于2.0，将青霉素从缓冲液再次转入到BA中（方法同前面所述），得二次BA萃取液。 3、脱色在二次BA萃取液中加入活性炭150300g/10亿单位，进行脱色，石棉过滤板过滤。 4、结晶,,思考题,1.青霉素系列产品有何特性？写出主要化学反应。 2.简述下列基本概念：发酵单位、效价、发酵总亿单位、发酵指数、基持转化率 3.青霉素产生菌是什么？其生长发育各阶段的主要特征是什么？ 4.青霉素生产的主要原理是什么？ 5.青霉素发酵过程的各种因素对发酵有何影响？ 6.青霉素发酵液预处理的目的是什么？生产中采用的方法是什么？,,7.青霉发酵过程中主要控制要点是什么？简述青霉素钾的生产工艺过程？ 8.试述青霉素钾盐结晶的方法有哪些？各自特点是什么？并分析水份、酸度、温度及醋酸钾用量对生产有何影响？ 9.在青霉普鲁卡因盐结晶时应如何控制晶体的纯度、 颗粒的大小及形态等。 10.采用共沸精馏生产青霉素钠盐应注意什么才有利？,,
