1、基 因 工 程 （GENETIC ENGINEERING）,戴五星,同济医学院生物化学与分子生物学系,基 因 工 程 （GENETIC ENGINEERING）,第一节 概 述,基因工程技术的定义,用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的工程技术。,克隆（clone）,指来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被称为副本或拷贝）。获取大量单一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,也称无性繁殖。 细胞克隆、个体克隆、分子克隆,细胞克隆（cell clone）,
2、细胞克隆（clone）:由一个细胞经无性繁殖而形成的细胞群体。,个体克隆（Organism cloning ）,个体克隆（Organism cloning）：即是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。克隆在园艺学上是指通过营养生殖产生的单一植株的后代。很多植物都是通过克隆这样的无性生殖方式从单一植株获得大量的子代个体。 克隆一个生物体意味着创造一个与原先的生物体具有完全一样的遗传信息的新生物体。目前，现代生物学背景下，这通常包括了体细胞核移植。,分子克隆(molecular cloning),分子克隆（molecular cloning）:指建立单一的重组DNA的无性
3、系的过程。即指在体外制备DNA，切割拼接成重组DNA，通过载体导入受体细胞，使重组DNA在受体细胞中扩增复制，形成单一DNA分子大量拷贝的过程。意指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群体。,克隆技术的应用前景,1.改良动物品种2.挽救濒临灭绝的物种3.培植人体皮肤4.研制名贵药品5.培育人体器官,第二节 工具酶,分子克隆技术中，DNA的切割、重组、修饰及合成都涉及一系列酶促反应，催化这些反应的酶是进行DNA操作的基本工具，故称为工具酶。,一、限制酶,（一）限制酶的定义,限制酶(restriction enzyme): 一类专门切割DNA的酶。是一类能识别双链DNA分子中的某种特定
4、核苷酸序列，并与其特异结合，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。 “Restriction endonucleases are bacteria enzyme which cut (hydrolyze)DNA into defined and reproducible fragments . In bacteria they form part of the restrictionmodification defense mechanism against foreign DNA. They are basic gene cloning tools .”,阿尔伯(Wemer A
5、rber 1929)瑞士生物学家，内森斯(Danien Nathans 19281999)美国微生物学家，史密斯(Hamilton OSmith 1931)美国微生物学家，由于限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用，为遗传工程的产生拉开了序幕而获得1978年诺贝尔生理学或医学奖。,（二）限制酶的发现,限制酶1.防御外源性DNA入侵。2.构成细菌种属和菌株之间交叉繁殖屏障，但又允许外源DNA有某些遗漏，利于物种进化。3.基因工程重要的工具酶。（350/400） 甲基化酶 1.保护自身DNA不受限制酶切割（限制）。2.影响DNA分子构象，利于基因表达调控。 甲基化酶:DAM methyla
6、se (DNA adenine methylase) is an enzyme that adds a methyl group to the adenine of the sequence 5-GATC-3 in newly synthesized DNA dcm - DNA cytosine methylase,（三）限制酶的分类与命名,1.分类（根据酶的组成、所需辅助因子及裂解DNA的方式）：型R.E复合酶：核酸内切酶、甲基化酶（修饰）、ATPase识别序列: 特异性识别15bp切割特点: 识别位点与切割位点不一致产生片段较大、识别后,要移动100-1000bp切割。型R.E M.W和亚
7、基组成类似类R.E，作用方式同 I 型。型R.E分子内部切割、特异性强、切割序列可知且固定。,2、限制酶命名的原则,（1）以该菌株的属名的第一个字母及种名的头两个字母组成三个斜体字母的略语表示 （2）同一种细菌若有不同菌株，则在属名种名后再加上株名 （3）若一个菌株中有几种酶时，以罗马字加以区分 （4）同一属细菌种名头两个字母完全相同，其中一个菌的酶可改用词头后的另一个字母来代替,第一个字母 该酶来源的细菌属名 大写英文字母第二、第三个字母 该细菌的种名 小写英文字母第四个字母 代表株名罗马数字 同株、不同酶发现的先后次序属 名 + 种 名 + 株 名 + 序号（大.斜） (小.斜) (大/小
8、.正) (正)E- Escherichia H- Haemophilus（EcoR I）co- coli （Hin d ）in- influenzaeR- RY13 d- RdI- 该株首次分离 - 该株第3次分离,限制酶命名举例：,（四）型限制酶的特性,1、各种限制酶具有专一的识别与切割序列：Sau3AI EcoRI Pst Sma 5 GATC GAATTC CTGCAG CCCGGG 3 3 CTAG CTTAAG GACGTC GGGCCC 5,Sau3AI EcoRI Pst Hga 5 GATC GAATTC CTGCAG GACGC 3 3 CTAG CTTAAG GACGTC
9、CTGCG 5,2、识别碱基对数目一般为： 46 碱基对，少数识别序列为8个或8个以上碱基对。,3、识别序列大多为二重对称： 具有回文结构（palindrom）。Sau3AI EcoRI Pst Sma 5 GATC GAATTC CTGCAG CCCGGG 3 3 CTAG CTTAAG GACGTC GGGCCC 5,4、多数限制酶的切割位点就在识别位点内，但少数限制酶的切割位点不在识别位点内，而在识别位点的旁侧。如Hga的识别位点是GACGC（5/10），切割位点在两条DNA链上分别在距识别位点5个和10个核苷酸处。Sau3AI EcoRI Pst Hga 5 GATC GAATTC C
10、TGCAG GACGC 3 3 CTAG CTTAAG GACGTC CTGCG 5,5、有的识别序列中存在简并序列（有的核苷酸位点可以不同 ）。简并序列： GTYRACY=C/TR=G/AYR=CG/CA/TG/TA Hind可识别4个特定序列,6、限制酶的切割方式有两种：,(1)识别序列内两条链上交错切割，产生单链突出的粘性末端 (2)对称处同时切断DNA的两条链，产生平端DNA片段,7、限制酶的切割产生三种不同末端,切割的结果：产生三种不同的末端平末端 blunt end 5突出 5- protruding （cohesive end ）3 突出 3 - protruding （over
11、hang tail）切割的化学本质：磷酸二酯键的断裂, 形成含5 P和3OH 末端的两个DNA片段。对一特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则切点数多，产生的片段小。,8、同功异源酶（isoschizomers）,同裂酶(isoschizomer)：又称异源同工酶，是指来源不同，但能识别和切割同一位点，切割DNA后产生相同末端的一类限制酶。例如：Hha和Cto的识别序列和切点都是相同的。5GCGC33CGCG5,9、同尾（裂）酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同类型的粘性末端。,BamH,Bgl,+,+,10、限制酶易失活，需注意酶活力的保存。,二、DNA连接酶
12、,DNA连接酶（DNA Ligase）T4 DNA连接酶催化一双链DNA3-OH端与另一双链DNA的5端磷酸 根形成3，5- 磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端连接起来。,T4 DNA连接酶（T4 DNA Ligase）,三、DNA聚合酶,1.依赖DNA的DNA聚合酶(DNA Polymerase),以单链DNA（SS DNA）为模板合成DNA的酶EColi DNA聚合酶 Klenow 片段 T7噬菌体DNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶,（1） EColi DNA聚合酶一条多肽链组成, MW:109 kDa, 含Zn2+三种活性: 5 3 DNA聚合酶5 3 核
13、酸外切酶3 5 核酸外切酶用途：1、切口平移标记DNA探针2、对DNA的3尾进行末端标记3、合成cDNA第二链,（2） Klenow 片段枯草杆菌蛋白酶裂解E .Coli 聚合酶 I产生两个片段，大片段的分子量76kD，又称Klenow 片段。两种活性： 5 3DNA聚合酶3 5外切酶活性用途：1. 填平5突出的粘端（补平3端），35 3553 5- 3 23末端标记（填平） 3合成cDNA第二链4. DNA序列分析,(3)耐热DNA聚合酶：在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对热的稳定
14、性差而未得到广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) 应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。,1）TaqDNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在75-80具有最高的聚合酶活性。75-80每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55时为22个核苷酸/秒；37和22时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。,Taq DNA聚合酶没有35外切酶活性。没有校正功能的。 Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3-OH端。
15、,2）Tth DNA聚合酶,在95 0C半衰期为20分钟，具有逆转录酶活性，可简化RT-PCR。但不具35外切酶活性，没有校对功能，催化聚合反应的错误掺入率为1/500,3）Vent DNA聚合酶,该酶在1000C时半衰期达95分钟，97.50C时半衰期长达130分钟，其扩增产物的长度可达10-13kb。Vent DNA聚合酶具有35外切酶活性，具有校对功能，错误掺入率为1/31000，忠实性比TaqDNA聚合酶提高510倍。,4）Pfu DNA聚合酶,此酶耐热性极好，在97.50C半衰期大于3小时，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比Taq DNA聚合酶高12倍。,2、依赖RNA的D
16、NA聚合酶（逆转录酶）,逆转录酶（Reverse Transcriptase ）依赖于RNA的DNA聚合酶，以RNA为模板合成DNA，合成方向为 5 3，无 3 5核酸外切酶的活性。还兼有RNaseH活性，可使DNA：RNA杂合体中的mRNA水解。 商品化产品：AML 鸟类成髓细胞白血病病毒颗粒中的RTase纯化而得。 MML Moloney小鼠白血病病毒颗粒制备而得rMML基因工程制品。,3、不依赖模板的DNA聚合酶,末端转移酶（末端脱氧核苷酰转移酶） （terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）功能：在M2+ 离子存在下，将脱氧核苷酸 （dNTP
17、）加到DNA的3-OH上用途：主要用于探针标记,用于在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。,末端转移酶的催化活性,四、其他DNA修饰酶,（一）碱性磷酸酶,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）功能：能除去DNA或RNA 5-端的磷酸基团用途：制备载体时，用该酶处理后，可防止载体自身 环化，提高重组效率。,外源基因克隆入质粒载体的过程,（二）T4多核苷酸激酶,催化两种反应：正向反应：将ATP的-磷酸直接转移到去磷酸化的DNA 5-OH末端，这种反应被称为正向反应。交换反应：在过量ATP存在下，T4多核苷酸激酶将磷酸化DNA的5端磷酸转移给ADP,然后DNA从-P32
18、_ATP中获得放射性同位素标记的-磷酸而重新磷酸化。可标记DNA的5-末端，可使缺失5-P末端的DNA发生磷酸化作用。,T4多核苷酸激酶的活性,T4多核苷酸激酶的交换活性,第三节 载体（Vector）,一、定义：携带目的基因片段进入受体细胞的DNA一个理想的载体应具备以下几个条件： （1）具有自主复制能力，以保证重组DNA分子在受体细胞内得到扩增。 （2）分子量小，小分子的DNA制备时不易损伤，小分子DNA限制酶的切点少。 （3）有较多的拷贝数，便于分离提纯。 （4）有一个或多个筛选标记，能给寄主（受体）细胞提供可选择的标记：如抗药性，营养缺陷型或显色表型等，以利于筛选。（5）具有多克隆位点，
19、便于目的基因片段与载体连接。(6)具有较高的遗传稳定性。,二、载体的分类,功能分类： 克隆载体表达载体 组成元件的来源分类:质粒（plasmid）载体噬菌体载体：如噬菌体载体、M13噬菌体载体杂合载体 (如粘粒cosmid)病毒性载体：逆转录病毒载体、腺病毒载体等人工染色体载体,三、克隆载体（cloning vector）,（一）克隆载体的功能：用来克隆和扩增DNA片段 （目的基因）的载体 具备条件：（a）必须是一个复制子，能在受体细胞中复制。复制起点 Ori复制区复制终点 term（b）带有抗药性基因Tet r：编码膜蛋白，阻止Tet进入细胞Amp r：-内酰胺环水解酶。Kan r： Kan
20、 P , neo pCam r：氯霉素乙酰基转移酶,（C）具有多克隆位点（multiple cloning sits，MCS ）载体上含有的一个人工合成的DNA片段，其上含有数个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位 具备条件：是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点（d）可导入受体细胞,（二）常用克隆载体,1、质粒载体 概念质粒（plasmid） 是独立于许多细菌及某些真核细胞染色体外共价闭合环状的DNA分子（covalant closed circular,cccDNA），能独立复制的最小遗传单位。,特点：分子量小、宿主内均稳定存在、有较高拷贝数。1个的遗传标
21、志，便于选择，如antibiotics+lac Z。含MCS，便于外源基因的插入。克隆容量 10kb，主要用于亚克隆片段。例pBR322 （4.3kb、MCS位于ampr 和tetr基因中间）pUC系列 （2.6kb、来源于pBR322 的ampr 、Ori、 LacZ片段，MCS位于LacZ片段中间）,1.pBR322质粒,有两个抗药性基因，每个抗性基因中均含有单克隆位点，外源DNA插入后使相应的抗性基因失活，宿主细胞失去相应的抗药性，不能在含相应抗生素的培养基中生长，这一现象称为插入失活。,质粒pBR322的抗性基因筛选示意图,2.pUC18/19质粒,有一个抗性基因，可用来筛选转化子。有
22、一个lacZ基因片段，编码-半乳糖苷酶氨基端的一个片段（）片段，某些改造的宿主细胞可表达-半乳糖苷酶的羧基端片段，质粒和宿主细胞共表达时才具有-半乳糖苷酶的活性，可使生色底物X-gal降解产生兰色的化合物，这种现象称-互补。,pUC18/19质粒的特点, 具有更小的分子量和更高的拷贝数，500700个/细胞。 lacZ基因赋予质粒组织化学染色特性，便于检测重组体。 具有多克隆位点，便于外源基因插入。,质粒pBR322,质粒pUC,3.穿梭质粒,具有两种不同复制起始点和选择记号，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒。例如：大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒；大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。重组DNA的操
23、作在大肠杆菌中进行，然后转入分支杆菌和酵母中表达。,2、 噬菌体,1 噬菌体（bacteriophage，phage),2 M13噬菌体（M13 phage）,1 噬菌体（bacteriophage，phage）,(1)生活周期：分为 lytic 和 lysogenic 期基因组结构：野生型为双链线性分子，在宿主细胞中成环状。 左侧（包装）、中间（非必须、整合/切离、重组）、右侧（裂解、调控）,噬菌体的粘性末端及其环化,(2) 噬菌体的包装,75%或105%长度的DNA 基因组的包装可以包装 中间的非必须区可插入9-23kbp的外源DNA（replacement vector） 左右臂连接的片
24、段过小不能包装（选择标志）,(3) 噬菌体改造的载体,由 噬菌体改造的载体已有100多种 分为两类：插入型载体，如gt系列置换型载体，如EMBL和Charon系列,2 M13噬菌体（M13 phage）,大肠杆菌纤维状噬菌体，基因组DNA为全长6.5kb的闭环ssDNA， 感染细菌后呈复制型dsDNA（RF DNA）。载体特点：a. 允许包装大于病毒单位长度的外源DNA，一般DNA测序的插入片段1kb；b. 感染细菌后，复制环状ssDNA，经包装形成噬菌体颗粒，分泌到细胞外而不溶菌。c. 分离ssDNA容易。如含有插入DNA，可用于测序、制备杂交探针、定点突变研究。,3、杂合载体粘粒,粘粒（c
25、osmid）由噬菌体的cos区与质粒DNA构建而成特点：含质粒的ampr 或 tetr 、Ori成分，可在大肠杆菌中 复制含噬菌体的cos区，可在体外进行包装含1个或多个酶切位点本身分子量小（6.5 kb 左右），可容纳40kb的DNA片段非重组体太小不能包装，只包装重组体，便于筛选,4、人工染色体,人工染色体(artificial chromosome):指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。 天然染色体基本功能单位包括复制起始点(replication origin)、着丝粒(centromere)和端粒(telomere)。复制起始点，保证了染色体复制，着丝粒保证了染色体分离
26、，端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断裂端，保证了染色体的稳定存在。 人工染色体为基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具。,酵母人工染色体,YAC(酵母人工染色体,yeast artificial chromosome),是在酵母细胞中用于克隆外源DNA大片段的克隆载体。可接受100-2000kb的外源DNA的插入,是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体,酵母人工染色体,优点 可以容纳更长的DNA片段，用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序列，从而保持了基因组特定序列的完整性，有利于物理图谱的制作。 缺点 （1）克隆外源基因易出现嵌合体。 （2）有些克隆不稳定。
27、（3）YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离。,细菌人工染色体,BAC(细菌人工染色体,bacterial artificial chromosome),是以细菌F因子为基础构建的克隆载体, 可接受300kb的外源DNA的插入,是人类基因组计划中基因序列分析采用的主要载体,特点 ：拷贝数低，稳定，比YAC易分离。,哺乳动物人工染色体,MAC(哺乳动物人工染色体,mammalian artificial chromosome)：类似于YAC的MAC尚在研究之中，它含有哺乳动物染色体基本功能单位。如果研究成功，可能成为很好的基因治疗载体和转基因动物载体。,哺乳动物人工染色体,上述载体主要为克隆载体
28、，用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点诱变。,应用领域 （1）有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析。 （2）研究哺乳动物细胞中染色体功能。 （3）对复杂的基因做功能分析。 （4）用于体细胞基因治疗。,二、表达载体（expressing vector）,（一）表达载体的功能：在受体细胞中表达外源基因的载体结构： 克隆载体 + 表达构件 原核生物表达真核生物表达ori ampr 基础上加转录和翻译相关elementMCS （二）原核（大肠杆菌）表达载体表达载体 = 克隆载体+表达元件“启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号”“PRBSMCSterm”,原核表达载体结构示意图,用T
29、7 表达系统质粒的基本结构元件,（三）原核表达载体的表达构件, 启动子（promoter）trp-lac启动子（tac）：杂合启动子，由trp启动子加lac操纵子中的操纵基因和SD序列融合而成。如：tacI ： 由 Trp的35 区、人工合成的46bp片段（含TATA box）和 Lac O区融合而成 tac12：由Trp的35区、 Lac 的-10区、Lac的 O区、SD序列融合而成（在lac阻遏蛋白高水平表达的lacIq 大肠杆菌菌株中，其转录可被抑制，加入异丙基硫代糖苷（IPTG）可诱导表达）宿主菌：RB791/XL-1-blue/SB221/JM109诱导表达：Lactose 或 IP
30、TG,T 7噬菌体启动子表达效率高，需要特殊的受体菌。宿主菌：如BL21（DE3），Jm109（DE3）带有lacUV5启动子控制下的T 7噬菌体RNA聚合酶基因，为溶原菌，可用IPTG诱导表达。噬菌体PL和PR启动子（温度敏感启动子）该启动子受控于温度敏感的阻抑物cIts857.温度诱导： cIts857在 37时， 阻抑转录42时， 去阻遏，激活转录宿主菌：Ecoli M5219 (被缺陷型溶原BP感染后，含有阻抑物cIts857的编码基因)PBV220/221（我国构建）,核糖体结合位点（ribosome-binding site，RBS ）RBS包括SD序列 和AUG起密码子（或单指S
31、D序列）转录终止序列（termination sequence）多数表达载体含终止子序列，从几十到800碱基对的长度。,（四）真核表达载体的表达构件,（1）真核表达载体的基本转录元件 原核序列（克隆用）+ 真核序列（表达用）复制子 真核抗药基因+真核表达组件抗药基因 （或真核复制起始点）Promoter / Enhance + Cloning Site+Terminater + PolyA-adding Signal 启动子（promoter）和增强子（enhancer）必须用真核启动子和增强子，但活性差异较大。常用病毒的元件，如SV40病毒早期基因增强子、Rouse肉瘤病毒（RSV）的LTR
32、、人类巨细胞病毒（CMV）等,转录终止和加尾信号,真核细胞中转录后，准确地加poly（A）尾依赖于：poly（A）加尾信号 AAUAAApoly（A）位点及其下游的GU-rich区或U-rich区真核表达载体必须含有上两部分，以弥补内源性序列本身的不足。常用SV40的加poly(A)信号：237bp的BamHI-Bcl I酶切位点片段，同时含有早期和晚期转录单位的切割和加polyA信号，两套信号作用相反，分别位于不同的DNA链上，对mRNA的加工均有效。,哺乳动物表达载体,1.表达载体的种类,（1）病毒载体整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞的染色体整合。如pSV系列载体游离型载体：外源
33、基因与这种载体重组后，以病毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒等。 （2）质粒载体常常是穿梭质粒载体。既含原核的复制位点和 筛选标记，又含真核的复制位点、筛选标记和表达构件。,pcDNA3.1质粒物理图谱,第四节 重组DNA技术的基本过程,重组DNA技术的基本步骤： 制备目的基因和相关载体 将目的基因和有关载体进行连接 将重组的DNA导入受体细胞 DNA重组体的筛选和鉴定 DNA重组体的扩增、表达和其它研究,重组DNA技术的应用目的,1.获得足够的DNA片段以分析基因的结构；2.获得基因用于发展农业、林业、畜牧业和医学,目的基因,指要研究或应用
34、的基因，也就是要克隆和表达的基因。,一、目的基因的制备（Isolation）,（一）直接从染色体中分离,如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。,（二）化学合成法,要求： 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 基因小已报道的合成基因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素II、集落刺激因子等，这些基因均已被克隆，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。,（三）用逆转录酶合成cDNA,以mRNA或RNA为模板经RT合成cDNA。然后经过基因克隆，从而获得某种特定的基因。适于高丰度的mRNA。,（四）PCR或RT-PCR,根据目的基因的
35、核苷酸序列设计一对引物以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因。以mRNA或RNA为模板经RT-PCR扩增目的基因。,三种不同引物引导的RT-PCR示意图,1.从基因组文库（genomic library）筛选目的基因采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因组文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。从细胞中分离基因组DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。,（五）从基因组文库和cDNA文库筛选目的基因,组织或细胞染色体DNA
36、,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,* 从基因组DNA文库获取目的基因,2.从cDNA文库（cDNA文库）筛选目的基因,将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为 cDNA文库。,二、载体的选择和制备（Digestion）,（一）载体的选择（主要考虑以下5个条件） 1.有足够容纳目的基因的幅度 根据克隆外源DNA片段的大小选择合适的载体 2.构建DNA
37、重组体的目的 克隆选克隆载体，表达选表达载体 3.载体MSC中的酶切位点 根据克隆外源DNA的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体 4.根据受体细胞的类型确定表达载体的类型 5.载体克隆位点的阅读框要与目的基因的阅读框匹配,（二）载体制备的方法,获得载体后，用适当的限制酶切割载体DNA分子，获得线形分子。尽量用与消化目的基因时相同的酶来切割载体，以便获得相同的粘末端，便于连接。,1.碱变性法、 2.羟基磷灰石柱层析法 3.释放法 4.酸酚法 5.溴乙锭-CsCl2密度梯度离心法,三、 DNA的体外重组,（一）粘性末端连接： 用同一种酶或两种不同酶裂解DNA后，产生相同的粘性末端，很容易按照碱基配
38、对的原则以氢键结合，在T4DNA连接酶的作用下，共价闭合。 连接方式： 定向取代 双向插入（正向/反向）（双酶切） （单酶切） 措施：载体酶切后，用AP（碱性磷酸酶）水解5端的磷酸基团防止载体的自身环化。,同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接,DNA分子的体外重组过程示意图,外源基因克隆入质粒载体的过程,双酶切DNA片段粘性末端的连接,（二）平端连接,不同方式产生的平端DNA片段可以在T4DNA连接酶的作用下，与某些限制酶产生的平端载体相连接。在连接时，所用的ATP及T4DNA连接酶的浓度要比连接粘末端的高些。,1.利用人工接头（linker）连接：,接头：指化学合成的一段由1012个核
39、苷酸组成的具有一个或数个限制酶识别位点的平末端双链寡核苷酸短片段。,连接物分子连接平末端的DNA片段示意图,2.加衔接头连接,衔接头：人工合成的一段DNA片段，一端为平端，另一端为某种限制酶粘性末端。当衔接头与外源DNA分子连接后便形成了带有粘性末端的新的DNA分子，可与经同样限制酶切割的载体分子互补连接。如：AATTCGAGTCTTACGGCAGCTCAGAATGCCGT,3.加入同聚体尾（homopolymeric tail）连接,TdT：末端转移酶，可将某种单一脱氧核苷酸逐一加到 3- OH上去。 底物：3 粘性突出末端,四、外源DNA导入受体细胞,受体细胞应具备下列条件: 1.安全宿主
40、菌（或宿主细胞）在人肠道几无存活或存活率极低 2.限制酶缺陷型，外源DNA进入受体菌不被降解 3.重组缺陷型，保证外源DNA不与细菌基因组DNA重组，独立存在 4.能发展成感受态细胞的菌株 感受态：是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态 感受态细胞：指经过一定方法处理后具备接受外源DNA能力的细胞,（一） 转化（transformation）,定义： 将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 过程：细胞低温CaCl2处理感受态细胞加重组DNA42热休克重组体吸入细胞复苏涂板（含抗生素）筛选转化菌落。 其它方法：电转化、PEG法等。,重组DNA转化过程示意图
41、,（二） 感染（fection）,以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组DNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（transduction）。感染效率转化效率,（三） 转染（transfection）,真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。进入细胞的DNA可以整合到宿主基因组中，也可游离于染色体外存在和表达。,五、重组细菌和细胞的筛选,根据重组子的表型和结构特征进行筛选 1、根据重组子表型进行筛选（1）抗生素筛选： 所有的克隆载体均带有可供选择的遗传学标志或特征，如某种抗生素的抗性基因，为选择提供方便。（2
42、） 营养缺陷型的互补筛选插入互补插入失活,组氨酸缺陷 型大肠杆菌,无组氨酸 的培养基,酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,(插入失活法) 抗药性标记选择,插入失活示意图,a 互补（ a- complementation）,某些质粒（如PUC系列），含有大肠杆菌的lacZ基因片段，在该基因区又有MCS，这些质粒将导入 lacZ- 的宿主菌中表达。如果无外源基因插入：则质粒lacZ基因正常表达和宿主菌的lacZ基因互补，产生有活性的 半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物，产生blue clony。如果有外源基因插入：则质粒编码的lacZ基因失活、菌体
43、不可能互补产生 半乳糖苷酶，产生white clony。, 互补的检测,（1）酶切鉴定,挑选单个菌落扩大培养小量快速提取质粒酶切（根据插入片段上的酶切位点选定）分析有无插入片段、插入片段大小及数量、插入方向等。,2、根据重组子结构特征筛选,（2）核酸杂交法菌落原位杂交,从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，它与目的基因的表达与否无关。,原位杂交,（3）PCR筛选法,针对插入重组体中的目的基因，设计一对引物，进行菌落PCR，如能扩增出条带，则为阳性克隆。,（4）DNA序列测定,目的DNA片段的序列必须用DNA测序法加以证实。,基因工程的基本过程,第五节 克隆基因的
44、表达,一、表达系统分类 按克隆基因与受体细胞不同组合分为4类1.原核基因在原核细胞中表达，例基因工程生产各类工具酶2. 原核基因在真核细胞中表达，如-gal在昆虫细胞中表达3.真核基因在原核细胞表达，如IL-2,INF-等4. 真核基因在真核细胞表达，如人-干扰素和-干扰素在昆虫细胞中表达， -干扰素在小鼠细胞表达 按受体细胞表达类型分2类1、原核细胞表达系统（大肠杆菌、枯草杆菌等）2、真核细胞表达系统（酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞）,二、克隆基因在大肠杆菌中的表达,（一）真核基因与原核基因的差别1、真核基因较大，有内含子，原核生物无剪接内含子的功能2、缺乏E.coli RNA聚合酶识别的启动
45、子3、无SD序列，不能与E.coli核糖体小亚基16srRNA结合，不能翻译4、真核蛋白易被E.coli蛋白酶水解,（二）构建策略：,一）目的基因：表达真核基因必须克隆cDNA片段,表达分泌蛋白必须去除真核信号肽序列,ATG的5端非编码区必须去除 二）载体选择：必须是大肠杆菌的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。商用载体已含P和SD序列，无须构建。启动子的条件：转录效率高和可调控PL、tac、T7启动子能满足上述要求,三）目的基因和载体的连接,1. 产生非融合蛋白时目的基因与载体的连接方式：例如pRSET载体的SD序列3端下游适当位置构建的NdeI(CATATG)位点，此ATG可作为起始密
46、码子。目的DNA片段5端引入NdeI（CATATG）酶切位点，利用其中的ATG作为起始密码子。,2.产生融合性蛋白时载体与目的基因的连接方式,构建5原核3真核融合基因的表达载体：例如pRSET质粒优点为较稳定，不易被菌体蛋白酶水解；原核多肽部分有利于分离纯化；原核部分可被水解；原核部分可加入信号肽，构成分泌蛋白。注意事项：读框漂移（frame shift）,3.产生分泌性蛋白时目的基因和载体的连接方式,在载体的起始密码子ATG的3紧接一段编码原核信号肽的核苷酸序列。紧接着是多克隆位点，用限制酶切开后，将目的基因插入信号肽核苷酸序列的3端。表达的蛋白即为分泌性蛋白。,四）受体菌株和诱导条件,选择
47、几种菌株，以获得最好的表达效率根据启动子选择特定的菌株PL 启动子 要求cIts857阻遏物、T7 启动子 要求T7 噬菌体的RNA聚合酶诱导条件根据启动子类型和表达蛋白质而定,三、克隆基因在哺乳动物细胞中的表达,（一）目的基因：cDNA 或 genome DNA（二）载体：真核表达载体。先在原核中扩增、提取和纯化载体、再导入哺乳动物细胞。（三）真核细胞中重组体的抗性筛选标志：neor 氨基糖苷磷酸转移酶（aph）失活G418hygr 潮霉素B磷酸转移酶失活hydromycin B（四）无须诱导启动子表达，但在不同的宿主细胞中的表达效率不同。（五）得到转染细胞后，可加药物培养并逐渐加大浓度，增加选择压力，以增加目的基因的拷贝数。,第六节 真核细胞转染,一、真核细胞转染的基本方法和原理 （一）磷酸钙共沉淀法（calcium phosphate co-precipitation）DNA+Ca3（PO4）2 细胞摄取。转染效率可达1%。筛选后，可得稳定的转化细胞株。（二）电穿孔法（electroporation）高频电流作用下，细胞膜出现许多小孔，使外源DNA进入，并整合，建立稳定细胞株。（三）DEAE-葡聚糖法（DEAE-Dextran）DEAE-Dextran带大量的正电荷，与荷负电的DNA磷酸基团结合，黏附于细胞表面，内吞入细胞。快速、简单，可用于外源基因的短暂表达研究。,
