1、酶含量的调节（主要通过基因表达调控来影响蛋白质含量）,基因表达（gene expression）特定核苷酸序列的转录和翻译。,原核生物：基因组结构简单，转录和翻译可以在同一时空进行； 真核生物：基因组结构复杂，转录和翻译在时间和空间上均被隔开，还需进行转录后和翻译后加工。,2.1 酶蛋白的合成,大肠杆菌（E.coli）基因组约含4000个基因，只有5高水平表达；人类基因组约含3.5万个基因，只有2高水平表达。,有些基因在各种细胞内都是以恒定水平表达的，这些基因被称为管家基因。以恒定水平表达的方式，被称为组成性表达。(如-actin, G3PD),可诱导基因： 有些基因需在特定环境信号刺激下才能
2、表达，被称为可诱导基因。能增强基因表达的物质，称为诱导剂（inducer）。可阻遏基因另有一些基因在特定环境信号刺激下，表达水平下降，称为可阻遏基因。能阻抑基因表达的物质，称为阻遏剂(repressor)。,操纵子（operon）是由功能上相关联的多个编码序列（结构基因）及其上游的调控序列串联在一起构成的一个转录协调单位。,2.1.1 原核生物基因表达的调控（转录水平）,Jacob and Monod (1961),操纵子,调节基因 启动序列 操纵序列 编码序列(结构基因, S),A B C,CRP 结合位点,多顺反子mRNA功能相关联的 数个蛋白质,cAMP-CRP 结合部位,RNA聚合酶
3、附着部位,阻遏蛋白,阻遏蛋白受体部位,控制区（调控序列）,信息区,转录,翻译,I,P,O,操纵子,调控序列,操纵序列 启动序列 CRP结合位点 调节基因,编码序列（结构基因）,多顺反子mRNA： 功能上相关联的多个结构基因受控于同一个启动序列，被转录成一个mRNA、翻译成多种蛋白质，这种mRNA被称为多顺反子mRNA。,2.1.1.1 诱导剂诱导酶蛋白合成的机理,（基因表达与培养液中存在的碳源有关） （1） 培养液中存在高浓度Glc, 或Glc 和 Lac同时存在时，E.coli优先利用葡萄糖“葡萄糖效应”；主要通过阻遏蛋白的负性调控，使Lac操纵子结构基因关闭； （2）Glc被耗尽，或存在高
4、浓度Lac时，可以通过乳糖诱导，使基因开启；并需要CRP-cAMP的正性调控。,乳糖操纵子（lac operon）,Regulator gene promotor operator structural genes,CRP,z,y,a,p,o,i,CRP site,Repressor,阻遏蛋白的负性调控,RNA Polymeras,培养液：高浓度Glc, 或Glc和Lac同时存在时，E.coli不利用Lac,lac 操纵子,Regulator gene promotor operator structural genes,CRP,RNA聚合酶,z,y,a,p,o,i,CRP site,allo
5、lactoseLactose,mRNA,透性酶,转乙酰酶,半乳糖苷酶,乳糖的诱导作用,5,3,培养液：Glc耗尽后，或只存在Lac时， E.coli需利用Lac,乳糖是一种弱诱导剂，诱导能力有限，需要CRP的促进作用。即： “ Lac诱导CRP的正性调控”CRP是变构蛋白，其活性需cAMP的变构激活（CRP-cAMP活性复合物形式）。cAMP的水平又受葡萄糖浓度的影响。,激活PDE 高浓度Glc分解代谢产物 cAMP水平 不能激活CRP抑制ACLac操纵子缺乏CRP-cAMP的正性调控,启动Lac的诱导作用 Glc耗尽后PDE、AC cAMP水平CRP-cAMP 与 CAP位点结合促进RNA
6、pol 活性增强基因转录活性,（出现Glc效应的原因）,lac 操纵子,Regulator gene promotor operator structural genes,CRP,CRP-cAMP,RNA聚合酶,z,y,a,p,o,i,CRP site,allolactose,mRNA,透性酶,转乙酰酶,半乳糖苷酶,5,3,CRP-cAMP的正性调控作用,Lac 操纵子基因转录的调控 （1）受阻遏蛋白的负性调控和CAP的正性调控的协调作用，控制基因转录速率；（2）在Glc和Lac都存在时，优先利用Glc,通过阻遏蛋白的负性调控，关闭基因；（3）Glc耗尽后，乳糖作为诱导剂，并通过cAMP-CR
7、P正性调控，促使基因转录。,IPTG: 异丙基硫代半乳糖苷(强诱导剂),2.1.1.2 阻遏剂阻抑酶蛋白合成的机理,调节基因表达无活性的阻遏蛋白， 不能与操纵序列结合， RNA聚合酶催化基因转录，基因开放。,色氨酸作为辅阻遏物，与阻遏蛋白形 成有活性的辅阻遏物阻遏蛋白复合 物。活性复合物与操纵序列结合阻止 RNA聚合酶移动，基因关闭。,色氨酸操纵子（Trp operon）,O,trpR,P,trpE,trpD,trpC,trpB,trpA,转录产物5端有一162bp长度的前导序列，其中含有能形成“衰减子”结构的序列。,（结构基因）,调节区,在高浓度色氨酸存在下，通过形成特殊的“衰减子”结构，对
8、转录进行更加精细的负性调控。,“前导序列”含有、 4个互补的短序列。序列中含有编码14个aa.的前导肽。,衰减子结构attenuator,10、 11,、序列互补配对，形成衰减子结构,色氨酸操纵子的“衰减子”调控,通过前导肽的翻译，控制转录进程。 这是原核生物普遍存在的精细而灵敏的转录调控机制,2.1.2 真核生物的基因表达调控真核生物基因组结构特点 （1）基因组结构庞大 3 X 109bp , 约含3.5万个基因, 95为非编码区 （2）由DNA、组蛋白和酸性蛋白形成超螺旋管的染色体结构而存在 （3）含大量重复序列（高度/中度/反向重复序列） （4）结构基因为单拷贝序列,单顺反子转录 （5）
9、断裂基因（内含子、外显子间隔排列）,染色体的组装,断裂基因（splite gene）,真核生物基因表达调控多级调控（1）基因自身结构变化基因丢失基因扩增基因重排DNA甲基化修饰(形成5M-CpG，使基因沉默)（2） 转录水平 转录起始 、 转录后加工、转录产物的转运 （3） 翻译水平翻译后加工、靶向运输,2.1.2.1 真核基因转录水平上的调控DNA 真核生物染色质组成 组蛋白（富含Arg、Lys） 非组蛋白（酸性蛋白）,基本单位： 核小体,2.1.2.1.1 组蛋白与非组蛋白由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2分子组成八聚体为核心，外绕1圈DNA双链（146bp）, 构成核小体，核小体之间
10、含1个H1组蛋白，由一条DNA链串连起来形成念珠样结构。,组蛋白通用阻抑分子： 组蛋白乙酰化、磷酸化 降低与DNA的结合力，促进转录。 组蛋白甲基化 促进DNA甲基化，降低DNA转录活性。 非组蛋白去除组蛋白对DNA的抑制；（转录调控因子）,核小体,H1,DNA,2.1.2.1.2 RNA聚合酶及转录起始因子真核生物RNA聚合酶（三类） RNA pol 催化合成45S rRNA前体分子；再加工为28S、18S和5.8SrRNA； RNA pol 主要负责催化5S RNA、tRNA和7S RNA等小分子RNA的转录； RNA pol 催化几乎所有编码蛋白质的结构基因转录，先转录生成hnRNA，再
11、加工为mRNA。,RNA pol 的作用需一大类转录因子的协助 （1）与RNA pol对应的转录因子为TF类 （2）TF类转录因子有A、B、D、E、F、H、J等多种亚型 （3）转录启动前，TFD与RNApol及其他TF类转录因子按一定时空顺序结合先形成PIC。（已知TF类转录因子参与几乎所有转录过程， 又被称为通用转录因子,转录前起始复合物（PIC）的形成,2.1.2.1.3 顺式作用元件（cis-acting elements）,是指真核生物基因组中参与调控自身DNA链内结构基因转录活性的特异碱基序列(调控序列) 。,GGGCGG,TATAAT,CAAT,-60100bp -4060bp -
12、2530bp,启动子（promoter） 根据顺式作用元件的作用和位置 又有 增强子(enhancer)沉默子(silencer),启动子 结构基因,转录起始点（1）,编码链（）模板链（）,增强子,5,3,（1）启动子位于转录起始点上游，能被RNApol识别、结合，启动转录的一段碱基序列。常有特殊的共有序列：共有序列TATA盒、GC盒、CAAT盒等 TATA盒（核心序列）是TFD和RNA Pol结合位点,（2）增强子是增强启动子转录活性的特异碱基序列。（远离转录起始点，位置灵活，其作用与方向、距离无关）,（3） 沉默子对基因转录起阻遏作用的特异碱基序列，属于负性调控元件。,启动子作用前，需要与
13、通用转录因子、RNApol结合 外，还需其他多种调节蛋白的参与。增强子必需与特异调节蛋白结合后，才能发挥转录增强作用。根据作用性质，又分：组织特异性增强子受特异调节蛋白调节诱导性增强子受激素或细胞因子诱导产生调节蛋白。沉默子的负性调控，也必需与特异调节蛋白结合后发挥调节作用。,真核生物基因转录表达调控示意图,CAAT盒 GC 盒 TAAT盒 （1 ）promoter,2.1.2.1.4 反式作用因子（ trans-acting factor）能直接或间接与顺式作用元件相互作用，进而调控特异基因转录的一类调节蛋白。（或称转录调节蛋白、转录因子transcription factor, TF）。按
14、其功能不同，常分以下两类： 基本转录因子参与生成PIC的TF类调节蛋白 转录激活因子与增强子结合特异转录因子 转录抑制因子与沉默子结合,转录因子两个重要的功能结构域DNA结合域（DNA binding domain, DBD）转录激活域（activating domain, AD）锌指（zinc finger）结构DNA结合域(DBD) 亮氨酸拉链（Leu zipper）结构螺旋转角螺旋（helix-turn-helix, HTH）,转录激活域（AD）控制转录起始复合物的形成,并激活转录活性(富含酸性aa区、Gln区和Pro区),形成同源或异源二聚体，增强与DNA结合力。,常有两个或两个以上锌
15、指结构，利于插入DNA双螺旋的深沟并与之结合,2.1.2.1.5 反义RNA(antisense RNA)Mizuno and Simons(1983年)发现:能够通过碱基互补与细胞内同源mRNA（为正义RNA）结合，从而抑制mRNA翻译为蛋白质的RNA，称反义RNA。,1995年复旦大学Guo Shu博士在美国康奈尔大学实验：反义RNA注入线虫体内以阻断par-1基因表达正义RNA注入线虫体内（作对照）期待观察到增强效果,结果：两组线虫体内的par-1基因表达均被抑制,华盛顿卡内基研究院Fire A博士注意到，Guo博士研究结果已经不能单用反义RNA技术来解释了，推测可能还有其它的成分参与了
16、这一过程。,纯化的反义RNA 纯化的正义RNA dsRNA杂合体,分别注入线虫体内,对同源mRNA表达有弱的抑制作用有强烈抑制作用,实验结果证实dsRNA具有强烈的阻抑基因表达的作用,Fire A 将dsRNA对同源mRNA表达的阻断作用称之为RNA干扰（RNA interference, RNAi）。1998年，Fire将实验结果在Nature杂志一公布，迅即震惊了整个生命科学领域。,2006年，Fier A and Mello C 两人同获诺贝尔 生理学医学奖.,参与RNAi过程幷发挥重要作用的蛋白质,Dicer酶：主要作用：可将dsRNA降解成1825个核苷酸长度的片段，后者称为siRN
17、A(small interference RNA)。 RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）主要作用： 负责降解内源mRNA RISC是一种核蛋白复合物，具有螺旋酶、核酸外切酶、核酸内切酶和同源搜索区等多功能酶活性。,RNAi机制（基本过程）,RNAi技术的应用 1） 研究基因功能尤其可以将RNAi与基因组学研究结合起来，对特异基因进行筛选，确认特异基因的功能。目前已有报道利用RNAi技术确认了磷脂酰肌醇激酶和细胞核因子B的信号传导通路的基因。 2）已发现生物体内有数百种(micro RNAs)miRNA参与调控基因表达。,3）用于疾病
18、的治疗体外合成dsRNA, 利用RNA干扰技术对抗多种病毒感染 ：包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、流感病毒、人乳头状瘤病毒等，用于在易感细胞中防治感染产物的生成。 RNAi技术也用于对抗特殊的癌症基因：如黑色素瘤、胰腺癌、白血病。还包括心脑血管性疾病、神经退行性变等。,RNAi技术是近几年兴起的非常有效、特异性很高的转录后基因沉默技术。RNAi技术不仅在基础研究领域中被广泛运用，在临床研究中，如抗病毒、抗肿瘤、药物筛选等，也正在被广泛采用。RNAi孕含着巨大的科学价值和应用前景。,2.1.2.1.6 RNA加工剪接mRNA5加“帽”、3加“尾”，剪接tRNA形成反密码环、加上3CCAOH末端，
19、碱基修饰rRNA剪裁，与蛋白质组装成“核糖体”复合物,2.1.2.2 翻译水平的调控（1） 翻译前调节mRNA的稳定性（2） 选择性翻译mRNA（3） 调节翻译的起始（4） 翻译后加工,eIF-2 eIF-2-p(失活),eIF-2k,血红素,（）,Met-tRNA 40S小亚基 60S大亚基,起始复合物启动转录,人前胰岛素原 胰岛素（ 86aa / 11500 ） C肽、信号肽 （51aa / 9000 ）,2.2 酶蛋白的降解 （1） 溶酶体酶对各种蛋白质的降解（无特异性） （2） 泛素蛋白酶体途径（选择性降解）（泛素、泛素活化酶、泛素结合酶、泛素蛋白连接酶、泛素解离酶）变性蛋白 各种泛素蛋白依次结合 26S、20S蛋白酶体功能上受损蛋白 使靶蛋白打上标记 蛋白降解 突变蛋白 （ATP供能）,是真核细胞内重要的蛋白质质控系统,
