1、第一章 植物组织培养的基本知识,主要内容 植物组织培养定义及类型 植物组织培养的基本原理 植物组织培养的发展简史 植物组织培养在农业上的应用,目的与要求,掌握植物组织培养的概念与类型 掌握植物组织培养的基本原理 了解植物组织培养的特点 了解植物组织培养的发展简史 了解植物组织培养在农业上的应用,一、植物组织培养一般概念,定义：离体（in vitro)条件下利用人工培养条件在无菌情况下，对植物组织（器官、组织、细胞、原生质体等）进行培养，并使之生长、发育再生出完整植株的过程。外植体（explant)：由活体（in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。,二、植物组
2、织培养的类型,1. 依外植体不同分： 器官培养（organ culture） 茎尖分生组织培养(shoot tip culture,shoot apex culture,apical meristem culture) 愈伤组织培养(calluse cultrue) 细胞培养(cell culture) 原生质体培养(protoplast culture)愈伤组织（callus）:在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。,愈伤组织,二、植物组织培养的类型,按培养方法分为,固体培养 液体培养 看护培养 微室培养 包埋培养,二、植物组织培养的类型,3.按培养过程分为： 初代培养（
3、Primary culture）(无菌培养物)将从植物体上分离下来的第一次培养。继代培养（Subculture）（增殖培养）将初代培养得到的培养物转移到新的培养基上进行培养，称为继代培养。,三、植物组织培养的基本原理植物细胞的全能性,基本原理： 植物细胞的全能性（totipotent)：-植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性. 细胞差异：（1） 受精卵的全能性最高（胚性强） （2） 体细胞的全能性比生殖细胞的低。 实践证明：处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能
4、表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。,三、植物组织培养的基本原理植物细胞的全能性,植物细胞全能性的表达两个过程： 脱分化（dedifferentiation)：一个成熟细胞转变为分生状态的过程。恢复细胞的分裂活性。再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下转变为各种不同细胞类型的过程。,离体的植物器官、组织、细胞,脱分化,愈伤组织,再分化,根芽 胚状体,植物体,植物组织培养过程 （细胞全能性表达过程）,植物组织培养条件,含有全部营养成分的培养基(无机、有机营养、植物激素)、一定的温度、空气、光照、适合的PH、无菌
5、环境等。植物激素控制理论：细胞分裂素/ 生长素-可控制器官的分化：高-茎芽的分化；中-诱导愈伤组织；低-根的形成）,四、植物组织培养特点,培养条件可以人为控制在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。 生长周期短，繁殖率高由于人为控制培养条件，因此生长较快，一般2030d为一个周期。植物材料按几何级数繁殖生产，总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度
6、、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。,五、植物组织培养的发展简史,探索阶段（1902-1929年） 组培方法和定义的建立阶段（1930-1939年） 细胞全能性的证实阶段（1940-1959） 组培技术和理论迅速发展阶段（1960-今）,四个阶段,1. 探索阶段（1902-1929年）,Haberlandt：,基础：,贡献：,提出细胞全能性假设 实验-检验细胞学说,小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼
7、万年青属表皮细胞,无分裂,细胞高度分化+培养基中无生长激素,首次进行离体细胞培养,细胞学说,Knop+蔗糖,1904年：Hanning胚培养：培养萝卜和辣根菜的胚，得到植株,1922年：Kotte和Robbins根培养,1925年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种,其它研究,1922年：Knudson采用胚培养法获得兰花幼苗，克服其种子发芽困难的问题。,2. 组培方法和定义的建立阶段（1930-1939年）,1934年：White番茄根建立第一个活跃生长的植物无性系。当根2厘米长切成0.5-1厘米切断，无菌液体培养完全 相同的离体根根离体培养真正成功。28年-1600代。,1934年
8、：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了Callus,1937年：White发现3种B族维生素（吡哆醇、硫胺素、烟酸）和IAA对植物生长有用,1939年：Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功,1939年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功,1939年：Nobecourt培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功组织培养学科的奠基人,组织培养的奠基人,3. 细胞全能性的证实阶段（1940-1959）,1943年：White植物组织培养手册A Handbook of Plant Tissue Culture，标志组织培养成为一门新兴学科,1946年：罗士韦在菟丝子茎尖培养中观察
9、到花的形成，为试管受精奠定了基础,1948年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用，腺嘌呤/生长素高，生芽；低，生根；相等，不分化。,1952-1953年：美国科学家Steward F.C. 用胡萝卜根的细胞悬浮培养，发现单个细胞能经历象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植抹。证实了植物细胞全能性学说。 1952年：Morel和Martin首次报道茎尖分生组织的离体培养，获得无病毒大丽花植株。 1954年：Muir将烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一片滤纸，再在滤纸片上放上一 个烟草体细胞，单细胞培养成功。 1957年：Skoog、Miller
10、提出了激素控制理论（细胞分裂素/ 生长素-可控制器官的分化：高-茎芽的分化；中-诱导愈伤组织；低-根的形成）,4. 组培技术和理论迅速发展阶段（1960-今）,1960年以来组织培养理论、实践、技术和方法不断完善和发展，形成独具特色的专业技术在实验技术上建立了较完整的实验程序，已成为一种重要和精细的实验技术组织培养已广泛应用于生物学的许多分支学科，并取得丰硕的成果。,4.1原生质体培养,1960年：Cocking酶解法分离原生质体获得成功。使植物细胞可以象动物细胞一样进行细胞融合。,1971年，日本 takebe和Nagata首次利用烟草叶片分离原生质体并获得再生植株。,我国获得了30个以上品
11、种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、大麦、棉花、油莱、马铃薯等,4.2 细胞融合与体细胞杂交 1972年，美国Carlson诱导粉蓝烟草和郎氏烟草的原生质体融合得到种间体细胞杂种第一株体细胞杂种。 1978年，有性杂交不亲和的番茄/马铃薯间的体细胞杂交获得了杂种植株(Melchers)。随后获得了地上结番茄，地下生马铃薯的杂种植物。 1985年，马铃薯的栽培品种与野生种的体细胞杂交，得到了抗晚疫病和卷叶病的体细胞杂种(Austin)。,4.3 胚胎培养和试管受精 避免受精后胚乳发育不良或因种胚与胚乳间不亲和而致使杂种胚夭折，及时分离
12、幼胚接种在无激素培养基上使之直接成苗，这就是胚挽救。 大大提高远缘杂交的成功率。 印度科学家在裁培种菜豆、黄麻和花生的远缘杂交中获得了理想的重组体。 中国农科院蔬菜所培养结球甘蓝和大白菜的杂种胚得到了种间杂种。,4.4 组织及细胞培养生产有用物质Arregnin和bonner在1950年首先进行了培养橡胶茎愈伤组织获取橡胶的尝试。 近50年来飞速的发展。从400多种植物培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于其原植物，20种以上干重超过1。 在日本，人参细胞培养已达130600L发酵罐；德国用1000L发酵罐培养毛地黄细胞；在我国，人参细胞培养技术也已实现产业化。
13、利用培养细胞的生物转化能力生产高值化合物，德国科学家进行了出色的研究。他们在毛地黄细胞的培养中加入生物合成途径的中间化合物毛地黄毒素和一甲基毛地黄毒素，培养细胞以几乎 100的转化速率使之羟基化，变为医药强心剂地高辛。,4.5 单倍体育种 1964年，印度的Guba和Meheshiwari培养毛叶曼陀罗花药获得了第一棵单倍体植株。 我国于1970年开始这方面的研究，取得了很大的成果。 40种以上植物获得单倍体植株，其中小麦、玉米、橡胶树、杨树、辣权、油菜、柑桔、甘蔗、大豆、葡萄和苹果等的单倍体植株为我国首创。通过单倍体育种获得了水稻、小麦、烟草、辣椒和甜樱新品种。中花8号、9号等15个水稻新品
14、种，总种植面积达1000万亩。 通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。,花药培养：中花8号水稻、京花1号小麦。 体细胞无性系变异： 我国已经培育出抗白叶枯病及赖氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和酪氨酸含量高于亲本系的水稻变异体。 突变体诱导和筛选 细胞突变体的筛选最早始于1959年，G，Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。迄今为止，不少于15个科、45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的细胞突变体或变异体，有抗病细胞突变体、逆境胁迫抗性突变体、抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体等。,其他：,植物快速繁殖技术 60年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大
15、量繁殖兰花获得成功。植物快速繁殖技术、试管苗工厂化生产和无病毒种苗生产技术在70年代得到了快速的发展。 美国、法国、意大利、荷兰等欧美国家试管苗的年产量均在数千万株以上，并且以每年7-8的速度增加。我国快速繁殖和无病毒种苗生产的研究始于70年代，到“ 七五”期间研究成果开始向应用转化并大见成效。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植。,组织细胞培养物的超低温保存及种质库的建立 植物细胞全能性的发现和证实，为植物的种质资源的长期保存开辟了一条新途径。 许多植物的组织培养物在液氮中超低温保存以后，仍然能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。 如胡萝卜和烟草的悬浮细胞超低温
16、保存6个月以后仍然能恢复生长并分化出植株。,体细胞胚胎发生和人工种子 1958年，Reinert在胡萝卜的组织培养中最先发现了体细胞胚胎(胚状体)。水稻、小麦、玉米等100多种植物（43科、92属）能通过离体培养产生胚状体。 1977年，Murashige第一次提出人工种子构想。把胚状体包埋在胶囊内形成球状结构，使其具有种子的机能并可直接播种于田间。 80年代初，美、日、法等国相继开展了人工种子的研究，并且在胡萝卜、苜蓿、芹菜、花椰菜、莴苣、花旗松等植物上获得了初步的成功。 我国人工种子的研究开始于“ 七五”期间，并且被列人了“ 863高技术研究发展计划”。,六、应用领域,1、快速繁殖 运用组
17、织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如：一株葡萄一年繁殖到3万多株， 一株兰花一年繁殖到400万株。,2、种苗脱毒,针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 平均产量提高30%，最高达300% 目前茎尖脱毒苗已有100多种,3、远缘杂交,利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，克服远源杂交的不亲和性，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。,4、突变育种,采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用
18、逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。,5、基因工程,基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。,6、生物制品,有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物-紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量高达0.49gFW/（gFWd）的细胞系，每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg。,7、种质资源的保存,保存的材料：茎尖、花粉、体细胞胚、细胞系等 优点：小空间大存量；无干扰；便于携带；繁殖系数高。,返回,思考题,1概念：植物组织培养、细胞全能性、脱分化、再分化、愈伤组织、外植物体 2组织培养的类型有哪些？ 3组织培养的有哪些特点？ 4组织培养的具体应用有哪些方面？ 5器官分化与激素的关系。 6在组织培养技术的发展中做出巨大贡献的人。,参考书目：,1. 潘瑞炽.植物组织培养（第三版）.广州： 广东高度教育出版社，2003 2. 韦三立.花卉组织培养.北京：中国林业出版社 3. 谭文澄，戴策刚.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，1991 4. 崔德才，等.植物组织培养与工厂化育苗.北京：化学工业出版社，2003,
