1、Chapter 2 Structure and function of Nucleic Acids,Contents 2.1 细胞的遗传物质 2.2 核酸的化学组成与共价结构 2.3 DNA的二级结构 2.4 DNA 的超螺旋结构 2.5 真核生物的染色体及其组装 2.6 RNA 的结构和功能 2.7 核酸的性质 2.8 研究核酸的常用方法,第一节 细胞的遗传物质,一、DNA是主要的遗传物质 1、In 1869, Miescher：分离出核素 2、In 1930s, P. Levene and W. Jacobs RNA ：核糖，碱基 DNA ：脱氧核糖，碱基,3. In 1928, Fred
2、erick Griffith：细菌的转化实验,光滑型（S）肺炎双球菌可致小鼠死亡,粗糙型（R）肺炎双球菌不会导致小鼠死亡,加热杀死S型，小鼠不会死亡,将R型和加热杀死的S型混合后注射小鼠，小鼠死亡；,结果分析：R型在转化过程中从杀死的S型获得了基因（遗传物质）,4、DNA 是转化物质 In 1944, Oswald Avery （1）将S型杀死后分别提取多糖、脂类、RNA、蛋白质、DNA等分别加入R菌中， 仅加入DNA的发生了转化 （2）向提取液加入胰蛋白酶或糜蛋白酶，转化可发生 （3）向提取液加入DNA酶，转化不能发生,（4）直接的理化分析 超速离心（Ultracentrifugation）
3、转化的物质沉降的速度快 电泳（Electrophoresis）转化物质移动的速度快 紫外吸收转化物质在260nm波长处有最大吸收峰 基本化学分析：N/P比为1.67 结论：DNA是转化物质,5、噬菌体侵染实验：1952年, Hershey and Chase,二、 RNA 也是遗传物质 In 1957, Heinz Fraenkel-Conrat and B. Singer： 烟草花叶病毒重建实验,作为遗传物质的DNA具有以下特性： 贮存并表达遗传信息 能把遗传信息传递给子代 物理和化学性质稳定 有遗传变异的能力,第二节 核酸的化学组成与共价结构,一、 核酸的化学组成 核酸（Nuleic ac
4、id）核苷酸（Nucleotides）核苷（nucleosides）+ 磷酸 (Phosphoric acid)戊糖(pentose) + 碱基（Bases）,（一）碱基（Bases）：嘧啶碱和嘌呤碱,（二）核苷（Nucleosides）糖与碱基之间以糖苷键相连核糖核苷脱氧核糖核苷,（三）核苷酸（Nucleotides）,二、核酸的共价结构 （一）DNA的一级结构 DNA分子中的核苷酸序列 3，5-磷酸二酯键 5-末端: 自由的磷酸基团 3-末端: 自由的羟基,（二）RNA的一级结构 无分支的多聚核糖核苷酸链 4种核糖核苷酸：A、G、U、C 核苷酸中的戊糖为核糖,第三节 DNA的二级结构,一、
5、DNA双螺旋模型的诞生 In 1951, Pauling: -螺旋 Chargaff : A = T, G = C In 1952, Franklin and Wilkins: 清晰的X-射线衍射照片 In 1953, Watson and CrickDNA double helix model,二、双螺旋模型的特征 1、主链： （1）DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成,（2）两条主链围绕同一中心轴相互缠绕，形成双螺旋，螺旋方向为右手螺旋,（3）糖-磷酸主链位于双螺旋的外侧，碱基位于双螺旋的内侧； （4）碱基对平面与螺旋轴垂直,2、碱基配对,3、螺旋参数： （1）每一圈螺旋含10个碱基对
6、 （2）双螺旋螺距为3.4nm，上下相邻碱基的垂直距离为0.34nm，交角为36 （3）螺旋直径为2nm,4、大沟和小沟 大沟：宽1.2nm ，深0.85nm， 小沟 ：宽0.6nm，深0.75nm,三、维持DNA双螺旋的作用力 1、氢键（Hydrogen bonding） 2、碱基堆积力：堆积碱基间的疏水作用 3、其他作用因素： （1）范德华力； （2）磷酸基的负电荷斥力,四、 双螺旋结构的其他形式 B-DNA: Watson-Crick 模型 A-DNA: 在较低的湿度下形成；RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有A-DNA这种结构,Z-DNA: 左手螺旋的双螺旋DNA，其糖-磷酸骨架
7、呈Z字形,B-DNA是最常见的DNA构象（Watson-Crick双螺旋DNA）；A-DNA构象对基因转录有重要意义；Z-DNA可能与基因转录调控有关（左手螺旋）,五、十字形结构由 反向重复（回文序列）DNA形成,较长的回文结构(单链），可形成茎环结构(发夹结构),较长的回文结构，可形成十字形结构,六、三股螺旋DNA（Triple helix DNA） 1、类型： 分子内的DNA三螺旋结构（H-DNA） 分子间的三螺旋结构 平行的三螺旋结构,2、作用力 原来的双螺旋：Watson-Crick配对 第三股来链与双螺旋之一：Hoogsteen配对,Watson-Crick 配对 Hoogsteen
8、 氢键,3、意义：可能与基因表达调控有关形成三股螺旋结构可阻止调节蛋白的结合，从而关闭基因的表达,七、四链DNA 端粒DNA：G四链体结构,一、超螺旋DNA（Superhelix DNA） 1、定义：DNA双螺旋自身盘绕而形成的空间结构,第四节 DNA 的超螺旋结构,2. 功能：（1）超螺旋DNA具有更为致密的结构，可以将很长的DNA分子压缩到染色体中 （2）对DNA的稳定性具有十分重要的意义,3. 正超螺旋和负超螺旋 负超螺旋（negative supercoil） 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反 (2) 正超螺旋（positive supercoil）: 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负
9、超螺旋 正超螺旋,4. 超螺旋的定量描述White 方程：L=T+W （1）连结数（linking number , L）DNA闭环前两条链交叉的次数 （2）扭转数（twisting number , T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目 （3）超螺旋数（缠绕数 , writhing number , W）双螺旋DNA自身盘绕的次数,负超螺旋 正超螺旋双螺旋DNA松开导致负超螺旋，而拧紧则导致正超螺旋.,天然DNA分子一般为负超螺旋。 Why?负超螺旋DNA更易于局部解链，易于参加DNA的复制、转录等,（4）比连接差（）：表示DNA的超螺旋程度=（L - L0）/ L0大多数生物
10、的超螺旋程度大约在 -0.05左右,二、拓扑异构体（Topoisomers）具有不同连接数的相同DNA分子,Bp: 360; L: 36; T: 36; W: 0,Bp: 360 L: 32; T: 36; W: -4,Topoisomerase,三、拓扑异构酶（Topoisomerase）能够改变DNA连接数从而改变DNA分子超螺旋水平的酶 1、 I型拓扑异构酶 :作用机制：切开环状一条链，连接数改变1，不需ATP 2、 型拓扑异构酶 :作用机制： 切开环状两条链，连接数改变2，需要ATP,Type II topoisomerase,3、细菌的拓扑异构酶 （1）旋转酶（Gyrase-topo
11、isomerase II）：引入负超螺旋；与复制有关 （2）拓扑异构酶 I：松弛负超螺旋；与转录有关,第五节 真核生物的染色体及其组装,一、染色体和染色质 1、染色质（chromatin）指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白组成的线性复合结构, 是间期细胞遗传物质存在的形式。,2、染色体(chromosome):指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中, 由染色质聚缩而成的棒状结构。,3、二者关系 （1）染色质与染色体具有基本相同的化学组成，但包装程度不同，构象不同。 （2） 染色质与染色体是在细胞周期不同的功能阶段可以相互转变的的形态结构,二、真核生物的染色质1、Euchromatin（常染色质
12、）间期细胞核中，螺旋化程度小、分散度大、浅染的染色质 特点：转录活跃2、 Heterochromatin (异染色质）间期高度压缩，螺旋化程度高、深染的染色质特点：A、高度浓缩B、 转录不活跃C、在细胞周期中表现为晚复制(晚S期)、早凝缩,（1）组成性异染色质（结构性异染色质）在整个细胞周期内都处于凝聚状态的染色质（主要为卫星DNA，构成染色体特殊区域，如着丝粒） （2）功能性异染色质（兼性异染色质） 指在某些特定的细胞中，或在一定的发育时期和生理条件下凝聚，由常染色质转变而来的异染色质 如X 染色体，巴氏小体是真核生物基因表达调控的一种途径,三、染色体的结构（chromosome struc
13、ture）1、有丝分裂期的染色体,2、Centromere（着丝粒）指中期染色单体相互联系在一起的特殊部位, 是纺锤体附着位点（1）功能：保证有丝分裂和减数分裂中复制的染色体平均分配到两个子细胞,（2）着丝粒DNA：特点：含大量串联的重复序列-卫星DNA如酵母着丝粒DNA：88bp富含AT序列+两侧保守区哺乳动物着丝粒DNA：长序列+大量的重复序列,3、Telomere（端粒）是真核生物染色体末端的起保护作用的一种特殊结构（1）功能：保持染色体的稳定性,（2）端粒DNA：特点：A、短串联重复序列B、富含GCC、形成特殊的二级结构,四、真核生物染色体和染色质的组成（一） 化学组成： DNA /
14、protein（蛋白质）Non-histone 非组蛋白Histone 组蛋白H2A / H2B / H3 / H4/ H1,protein,（二）组蛋白（Histones） 核心组蛋白：H2A, H2B, H3 和 H4 1、种类非核心组蛋白：H1,2、组蛋白的特点： 分子量小（核心组蛋白：10-20 kDa ； H1 ：约23 kDa ） 高度保守 核心组蛋白都有一个组蛋白折叠结构域 碱性蛋白（20-30% Lys / Arg ），带正电荷 组蛋白肽链上氨基酸的分布具有不对称性 核心组蛋白的可进行组蛋白修饰,The core histones share a common structur
15、al fold, called histone-fold domain,The histone N-terminal tails stabilize DNA wrapping around the octamer,五、染色体的组装,（一）核小体 （Nucleosome） 1、定义：由200bp的DNA和组蛋白组成的染色体的基本结构单位,2、核小体的组装核小体核心-Nucleosome core组蛋白八聚体核心-octameric core histone (H2A /H2B / H3 / H42) 146bp DNA (1.8 turn, left-handed),Top view,Side
16、view,Nucleosome core 146 bp, 1.8 turn,染色体小体Chromatosome 166 bp, 2 turn,DNA,Histone octamer,Histone H1,H1 + 20bp DNA (stabilize)连接DNA-Linker DNA (0100bp, 55bp),Linker DNA,核小体-Nucleosome,核小体的形成,DNA（146bp） + Histone octamer (组蛋白八聚体),Nucleosome core (核小体核心) + H1 + 20bp DNA,Chromatosome (染色小体 166bp) + li
17、nker DNA,Nucleosome (核小体) (200 bp of DNA),Linker DNA100 bp average 55 bp,（二）10 nm纤丝 “Beads on a string” structure,Nucleosome,Histone H1,Nucleosome repeat: Core + linker DNA 200 bp,（三） 螺线管（30nm 纤丝）,螺线管（Solenoid),直径30nmleft-handed6 个核小体/turn,微带（miniband）是染色质的较高水平的组构,（四）微带（miniband）： 螺线管结合到核骨架/染色体骨架上形成
18、微带,微带盘绕形成染色体,第六节 RNA 的结构和功能,一、一级结构（primary structure） 与DNA区别：核糖 ；尿嘧啶； 通常是单链,二、二级结构（Secondary structure）部分序列自身回折形成局部双螺旋,tRNA,rRNA,G:U 碱基配对,hairpin,bulge,loop,假结（Pseudoknots）,四环（Tetraloop） 端环能够形成稳定的、保守的发夹结构 广泛分布于体内rRNA，催化RNA和非编码RNA中,三、三级结构（tertiary structure）,The crystal structure of a 23S rRNA,tRNA,四
19、、 RNA的功能 （1）储存遗传信息，如RNA病毒 （2）mRNA：进行遗传信息的传递，作为蛋白质合成的模板 （3）rRNA：可装配成核糖体，参与蛋白质合成 （4）tRNA：携带氨基酸，参与蛋白质的合成 （5）核酶：内含子的自我剪接等 （6）MicroRNA：基因表达的调控，在发育过程中起作用 （7）SiRNA：抑制病毒、转座子等外源基因的表达 （8）指导RNA：参与RNA的编辑 （9）SnoRNA：可能与RNA的甲基化有关 （10）SnRNA：参与RNA的加工（如剪接）,第七节 核酸的性质,酸碱性质 浮力密度 紫外吸收 变性和复性,一、酸碱性质： 1、DNA等电点44.5； 2、RNA 等电
20、点 22.5； 3、带负电荷,4、应用：琼脂糖凝胶电泳 电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 由负极向正极移动,二、浮力密度 (buoyant density)应用 ： （1）密度梯度离心-DNA的纯化8M CsCl（RNA DNA protein)（2）确定DNA平均GC含量=1.66+0.09% (G+C),蛋白质,染色体/线形DNA,超螺旋质粒,RNA,CsCl+EB,三、紫外吸收：DNA/RNA：max=260nmprotein：max=280nm A260：nucleotides ssDNA /RNA dsDNA,应用： (1) 核酸的定量1mg/ml：A260 =20（dsDNA）1mg/ml：
21、A260 =25（ssDNA/RNA） (2) DNA纯度的鉴定A260 / A280 =1.8，pure dsDNAA260 / A280 =2.0，pure RNAA260 / A280 1.0，pure protein,（3）判断DNA是否变性DNA的变性，紫外吸收增大（增色效应）DNA的复性，紫外吸收减小（减色效应）,四、核酸的变性和复性 （一）变性 (Denaturation) ：核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。,1、 碱处理 （alkali）DNA：酮 （keto） 烯醇式 （enolate） 变性2、 化学试剂尿素（Urea）， 甲酰胺（formamide）,
22、高PH,Application: In Southern blotting, before transfer, DNA is usually denatured with alkali.,Chemical DenaturationUrea (尿素）: denaturing PAGE Formamide （甲酰胺）: Northern blot,3、热变性（Thermal denaturation）（1）熔解温度（Tm）：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。,（2）影响DNA的Tm值的因素 DNA均一性 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性,测定Tm，可推知G-C含量 G-
23、C%=（Tm-69.3)2.44,Tm与（G+C）含量的关系, G-C含量与Tm值成正相关,（二）复性（Renaturation）变性DNA在适当（一般低于Tm 20-25）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。,退火（Annealing）,1、复性的特点： （1）热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 （2）DNA片段越大，复性越慢； （3）DNA浓度越大，复性越快。,2、应用: PCR: 引物与模板DNA的结合 Southern 和 Northern 杂交,第八节 研究核酸的常用方法,一、核酸的分离纯化 1、 DNA分离纯化 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或
24、高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNP可用苯酚抽提，还可用氯仿/异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-乙醇沉淀,2、 RNA的制备 （1）RNase 的灭活： 玻璃器皿：高温焙烤 塑料器皿：0.1% DEPC，37，过夜 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加特异的RNase抑制剂,（2）常用方法： 异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法 异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法蛋白质：1.33g/ml；DNA：1.71g/ml左右；RNA：1.89g/ml,mRN
25、A的制备： oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法,3、质粒DNA的提取 碱裂解法（alkaline lysis） 原理：根据环状质粒DNA与染色体DNA的拓扑学差异 pH值=12.012.5 ：染色体DNA变性双链解开，质粒DNA的双链仍紧密结合 pH值=中性（加入pH4.8的乙酸钾）：质粒DNA准确复性，染色体DNA缠绕成网状结构，通过离心与RNA、变性蛋白质一起沉淀，被除去。,菌细胞,1. 悬浮细胞 2. 溶菌酶处理 3. SDS/NaOH 4. 醋酸钾中和,培养液离心,接种、过夜培养 （3-5mL）,水相,Rnase A 二倍体积乙醇,CsCl+EB,二、核酸的超速离心 1、
26、测定核酸的浮力密度 2、测定DNA中GC的含量G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 3、溶液中核酸构象的研究 4、用于核酸的制备,三、核酸的凝胶电泳 1、琼脂糖凝胶电泳 （1）原理：电荷效应和分子筛效应 （2）DNA移动方向：负极到正极 （3）影响迁移率的因素： 核酸分子的大小 凝胶浓度 DNA的构象: 超螺旋 线形 带缺刻的环形 电压，不大于5V/cm,（4）染色：溴化乙锭-EB （0.5ug/ml）EB与DNA结合后，经紫外光的照射，可发出橙红色的荧光,（5）操作过程：a、制备琼脂糖凝胶（1 TAE缓冲液）b、胶板的制备 c、加样 上样缓冲液 （含溴酚蓝）d、电泳 5V/cm e、染
27、色 (溴化乙锭) f、观察 (紫外灯 ),2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 可用于分析和制备小于1Kb长度的DNA片段 多用垂直平板电泳 分辨率高，可将仅相差1 bp的DNA分开 制备和操作比琼脂糖凝胶困难,四、核酸的分子杂交 （一）原理：,复性,探针：一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在,（二）方法 1、 Southern 印迹（Southern Blotting） （1）用途：检测DNA （2）基本步骤：DNA样品 酶切 电泳 碱变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影,Southern 印迹实验,放射自显影
28、照片,（2）Northern 印迹 （Northern blotting） 基本过程： 1、RNA的提取； 2、RNA变性电泳； 3、RNA转膜和固定； 4、杂交； 5、检测。,Western-blot法 1）总蛋白质的提取 2）SDS-PAGE分离蛋白质分子 3）转膜 4）杂交（一抗、酶标二抗） 5）显色,Key points:,二级结构多样性 超螺旋结构 真核生物的染色体及其组装 核酸的性质 研究核酸的常用方法,Question,一、作业题： 名词解释： 染色体、染色质、常染色质、异染色质、组成性异染色质、功能性异染色质、超螺旋、正超螺旋、负超螺旋、拓扑异构酶、拓扑异构体、核小体、端粒、Z-DNA、核酸的变性、复性,二、思考题： 1、区分概念：常染色体与常染色质；核酸的变性与降解 2、利用核酸的电负性、浮力密度、紫外吸收、变性和复性的性质，可以做哪些分子生物学实验？,
