1、第三章 物理图谱,3.1限制性作图 3.2克隆作图3.3荧光原位杂交3.4序列标签位点作图3.5 遗传图与物理图的整合,遗传图的局限性遗传图的分辨率有限 大基因组的人类及多数高等真核生物不能获得大量的子代遗传图精确度有限,结构基因组学的发展,genetic mapping,physical mapping,genome sequencing,物理作图的常用方法：限制性作图(restriction mapping)基于克隆的基因组作图（clone-based mapping)荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)序列标签位点（seque
2、nce-tagged sites,STS)作图,3.1 限制性作图就是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置,限制性作图,Double restriction,Partial restriction,切点过多时可以采用末端同位素标记结合部分酶解进行绘图,只能应用于较小的分子 通常识别6bp的限制酶适合50kb以下DNA分子的精细作图大于50kb基因组可采用稀有切点限制酶进行限制性作图,稀有切点的酶分为两类： i. 识别具有7或8个核苷酸序列的酶 如SapI(5-GCTCTTC-3),SgfI(5-GCGATCGC-3) ii.识别序列所含基序在靶DNA中稀少的酶 人类基因组中CG序列很稀少
3、，因此含有此序列的限制酶切点很稀少，例SmalI(5-CCCGGG-3),产生78kb片段，NotI(5-GCGGCCGC-3),1Mb,大片段DNA的分离技术脉冲凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE) 将一个方向不断变换的电场，取代简单的单一电场（单向电场)，使电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭转迁移方向，较小的分子比较大的分子重新排列的快，以此达到分离的目的。分辨率达到10Mb,正交交变电场凝胶电泳(OFAGE)，有2对电极，分别位于凝胶对角线的两端，2对电极轮流接通和关闭，产生一个交替的方向不同的电场，DNA分子在凝胶中不断改变迁移方向,
4、DNA分子限制性位点的直接检测-光学作图光学作图：直接在显微镜下观察检测限制性酶切位点凝胶拉伸：将染色体DNA悬浮于融化的琼脂糖中，然后滴加到用限制酶包被的显微载波片上，当凝胶冷却时DNA分子呈伸展状态。然后用加入氯化镁激活限制酶，切割DNA分子，同时加入荧光染料使DNA分子染色，延伸的分子中的限制性酶切位点就逐渐形成缺口，可用高分辨率的荧光显微镜检测到分子梳理：将硅胶树脂包被的盖玻片浸入DNA溶液中，保留5分钟，使DNA分子的末端黏附于盖玻片上，然后以0.3mm/s的速度移动玻片，使DNA分子整齐排列在盖玻片表面，然后再加入限制性酶和荧光染料，就可以在荧光显微镜下检测到酶切的缺口,3.2 基
5、于克隆的基因组作图3.2.1 大分子DNA的克隆载体酵母人工染色体YAC (yeast artificial chromosome)细菌人工染色体BAC (bacterial artificial chromosome)P1人工染色体PAC (P1-derived artificial chromosome),3.2.1 大分子DNA的克隆载体YAC 利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体，能在酵母细胞中复制，是容量最大的载体，插入片段平均200-1000kb，最大可达到2Mb, YAC必需成分：着丝粒、端粒、复制起点ARS(autonomously replicating sequence)
6、和选择标记基因 缺点:不稳定，嵌合体比例高，容易断裂以及克隆效率低,SUP4 赭石突变抑制基因 与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。因此装载了外源 DNA 片段的重组子导致抑制基因 sup4 插入失活，从而形成红色菌落； 而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落,18,3.2.1 大分子DNA的克隆载体BAC是一种以F质粒及调控基因构建而成的细菌染色体克隆载体，
7、能在细菌细胞中复制。克隆能力为125-150kb，最大达到300kb，是物理作图中目前用得最多的大片段DNA载体 该质粒主要包括oriS，repE(控制F质粒复制）和parA、parB（控制拷贝数）等成分优点：嵌合体的频率低，转化效率高，而且以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化,3.2.1 大分子DNA的克隆载体PAC 噬菌体P1来源的载体，可克隆300kb的DNA片段，插入的外源DNA没有明显的嵌合和缺失现象 PAC除具有许多BAC载体的特征外,它的多克隆位点位于蔗糖诱导型致死基因sacB上,通过加入蔗糖和抗生素的培养基筛选出来的克隆都是含有插入片段的重组子缺点是PAC载体自身片段较
8、大(约16kb),构建文库没有BAC载体(约78kb)效率高,PAC 载体,3.2.2 克隆重叠群的组建 染色体步移法（chromosome walking) 指纹法（clone fingerprinting),3.2.2 克隆重叠群的组建 染色体步移法,用探针进行染色体步查,用PCR进行染色体步查,在微量滴定板中对克隆进行组合筛选,3.2.2 克隆重叠群的组建克隆指纹法克隆指纹法的原理：如果2个克隆彼此重叠，它们一定含有相同的顺序。指纹：指确定DNA样品所具有的特定DNA片段组成，这些DNA片段通过不同方式产生，经凝胶电泳后显示特定排列模式的DNA条带，即指纹。如果DNA克隆间含有部分相同的
9、指纹，说明它们之间含有部分重叠顺序，在基因组中相邻排列,限制性带型指纹,定义：用不同限制性酶消化后，经凝胶分离产生的条带。,重复顺序DNA指纹,定义：将不同克隆的限制性片段电泳转膜后，与基因组范围分布的重复序列杂交形成的带型。,重复顺序DNA PCR或分散重复顺序PCR指纹,定义：运用在重复序列内退火的引物，扩增两个相邻重复序列之间的单一顺序，得到的产物带型。,STS作图指纹,定义：根据STS序列设计引物，扩增文库当中的克隆，能扩出条带的克隆都含有序列重叠的插入子。,STS序列：序列已知的，在整个基因组是唯一的序列,3.3 FISH指在染色体上进行DNA杂交，以便识别荧光标记探针在染色体上位置
10、的方法通过原位杂交而绘制的基因或DNA分子标记所在的染色体位置又称为细胞图,荧光原位杂交流程,杂交探针非特异性位点的封闭,中期染色体由于高度凝缩，所以基于中期染色体FISH作的图分辨率低（分辨率1Mb)，中期染色体FISH常用来确定新标记在染色体上的大概位置用较为伸展染色体FISH作图，可以得到比较精细的图谱 机械伸展的染色体 可区分相隔200-300kb的标记 非中期染色体 分裂间期染色体，分辨率可达到25kb以下,3.4 序列标记位点作图（STS mapping)前几种作图方法都有缺点 限制型作图快速，但不适合大基因组； 克隆重叠群构建费时费力，指纹作图有时会出现错误； 原位杂交作图操作困
11、难，一次实验定位的分子标记不超过3-4个STS 作图是构建详细的大基因组物理图的主流技术,序列标记位点STS 指一段短的DNA序列,通常长度在100-500bp,易于识别, 在待研究的染色体或基因组中仅存有1个拷贝。因此当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这两个片段彼此重叠STS作图 通过PCR或分子杂交将特定DNA顺序定位在基因组染色体区段中,STS作图原理 在同一染色体或整个基因组随机断裂的DNA片段中，两个STS出现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的距离，彼此靠的越近，分离的几率越小，彼此相隔越远，分离的几率越大 两个STS之间相对距离的估算与连锁分析的原理一样，它们之间的图距根
12、据它们的分离频率来算,STS作图原理,3.4.1 STS一段DNA序列要成为STS，必须具备两个条件 序列已知，偏于PCR检测 在研究的染色体或整个基因组上只有唯一的定位获得STS途径 EST 如果EST来自于单一序列可作为STS SSLP 具有多态性且通过连锁分析进行定位的SSLP很有 价值，可以建立遗传图与物理图之间的联系 随机基因组序列 通过对克隆的基因组DNA随机测序获 得，或者从数据库中寻找,3.4.2 用于STS作图的DNA片段STS作图所必需的第二个要素是可覆盖待研究染色体或基因组的DNA片段群，这些片段有时被称为作图试剂（mapping reagents)获得作图试剂的两个途径
13、 辐射杂交 克隆文库,辐射杂交 辐射杂种（radiation hybrid) 含有其他生物染色体片段的啮齿类动物细胞 辐射杂种群 （radiation hybrid panel) 通过放射杂交产生的融合细胞群称为辐射杂种群 辐射杂种群分为两种： 全基因组辐射杂种群 单染色体辐射杂种群,辐射杂种的产生,全基因组辐射杂种的筛选 使用不能产生胸腺激酶（TK)或者次黄嘌呤磷酸转移酶（HPRT)的仓鼠细胞系作受体。这种细胞在添加了次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基（HAT）中不能存活。只有获得人体DNA中TK和HPRT基因的仓鼠细胞才能在HAT选择性培养基中生长，由此可获得一系列随机插入人类DNA片段的杂
14、种细胞，可作为作图试剂用于STS定位,辐射杂种的筛选,单染色体的辐射杂种群 构建：用x射线照射另外一类含一条人染色体的啮齿类（如小鼠）细胞系，再将这种细胞与仓鼠细胞融合。 筛选：用人类基因组广泛分布的重复序列如Alu（一类SINE)做探针，筛选只含有人染色体片段的杂种细胞,STS定位从杂种细胞分离DNA,用PCR检测杂种细胞中含有的STS标记，根据成对STS出现的频率，可判断这些标记是否连锁以及连锁程度前提是使用PCR方法鉴定STS时，不会从仓鼠基因组或者小鼠基因组扩增出相应的片段辐射杂种作图单位为厘镭（centiRay,cR),定义为DNA分子暴露在N拉德（rad)X射线剂量下，两个分子标记
15、之间发生1%断裂的频率。,Quoted from “radiation hybrid mapping,a somatic cell genetic method for constructing high-resolution maps of mammalian chromosomes”, Cox DR et al., Science 250: 245-250,断裂频率：,人类21号染色体辐射杂种物理图，图距为cR,克隆文库也可用作STS分析 克隆文库：将基因组或分离的染色体断裂成片段，克隆到高容量载体中所产生的DNA片段的集合 克隆文库STS作图的优势单独的克隆就可以提供测序的DNA，来自STS分析的数据可用来构建物理图谱，也可以确定含有重叠DNA片段的克隆，这就可以帮助我们建立克隆重叠群,基因组计划中克隆文库的价值,3.5 遗传图与物理图的整合遗传图和物理图根据不同作图原理，采用不同作图方法绘制，绘制的图谱有差别，必须进行校正整合遗传图和物理图的部分分子标记可能是不同的，可通过图谱整合，将标记整合到一张整合图上，提高分子标记密度，有利于下一步基因组测序和序列组装,
