1、细胞色素C的制备及测定,一、基本原理,细胞色素C的基本简介蛋白质及多肽类药物分离纯化的基本原则及注意事项,1. 细胞色素C的基本简介,生物氧化过程中重要的电子传递体。,主要存在于线粒体中，需氧多的组织含细胞色素C最多，如心肌及酵母细胞的细胞色素C含量比一般组织细胞的高。,氨基酸中含有较多的精氨酸，故呈碱性，等电点pI为10.210.8,它可分为氧化型和还原型两种，两者在水溶液中的颜色明显不同：其氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。其中还原型较氧化型稳定。,临床作用,细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧状态，在使用细胞色素C后就可以纠正其物质的代谢，使细胞
2、恢复正常呼吸，病情得到缓解或痊愈。细胞色素C目前在临床上虽非特效药物，但可用于缺氧急救、解毒及其辅助治疗，是治疗组织缺氧及由缺氧所引起的一系列症状的重要生物药品。,1.原料的选择和预处理,2.原料的粉碎；,3.提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程；,4.纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程；,6.成品及.制剂，即半成品或原料药经精细加工制成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。,5.干燥及保存；,2. 蛋白质及多肽类药物分离纯化,二、实验基本过程,细胞色素C的制备细胞色素C的含量测定,细胞色素C的
3、制备,取新鲜或冰冻猪心除去脂肪和韧带用水洗去积血切成小块放入绞肉机绞碎,1. 材料处理,每组称量碎肉 x g，加自来水2x mL ，搅拌 用2mol/L H2SO4调pH 4.0（需不断调整） 搅拌提取2h 用1mol/L NH4OH调pH6.0 用四层纱布挤压过滤，收集滤液， 肉渣回收,2. 提取,自来水1.5x mL; 搅拌提取1h,3. 中和,合并滤液, 用1mol/L NH4OH调pH 7.2 静置30min，使溶液分层 过滤除杂质,4. 吸附和洗脱,每组称人造沸石11g 合并清液 浮选 平均分成两份自来水装柱 上样（1 ml/min） Cyt.C吸附 取出浮石，放入烧杯中，依次用自来
4、水、去离子水、 0.2% NaCl、去离子水清洗 装柱后用25% (NH4)2SO4洗脱（流速小于2mL/min）,5. 盐析,收集红色洗脱液，量体积（控制在10mL左右） 每100mL洗脱液加20 g固体(NH4)2SO4，边加边搅拌至(NH4)2SO4完全溶解，并有沉淀析出 室温静置30 min 滤纸过滤，收集滤液，量体积,6.三氯醋酸沉淀,按8% 体积滴加20% TCA，边加边搅拌 立即离心（3000rpm，15min） 收集 沉淀,若上清液仍为红色，倒出后再补加5% 体积的TCA，再次离心，收集沉淀 Cyt.C沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过5mL）,7. 透析,溶解液装入透析袋 对
5、自来水、去离子水透析，用Ba(Ac)2检测透析袋周围水的SO42- 过滤除去不溶物,得到Cyt.C粗品液，量体积，测定其含量,细胞色素C的含量测定,1. 已知标准细胞色素含量和对应的光密度值的标准曲线,2. 样品测定1ml样品稀释适当倍数加少许联二亚硫酸钠（还原剂）520nm处测定光密度。,实验结果,细胞色素C的含量(mg):3.71OD稀释倍数终体积1/4,或: 3.71OD稀释倍数终体积1/4500/猪心重量,（特定猪心重量中所获得的细胞色素C的量）,注意事项,1尽可能除掉猪心中的韧带、脂肪和积血。2使用离心机之前，一定要配平。3透析之前要检查透析袋。4在520nm处测得各管的光密度时，要加少许还原剂。,
