1、应用四环素表达系统上调内源性TGF-1表达对HL-60细胞 增殖、分化及凋亡的影响 研究生：杨大柳 导师：陈元仲,前 言,TGF-1是迄今为止了解的功能最复杂的细胞因子之一，目前已知的功能主要有调节细胞生长和分化，诱导细胞凋亡，影响细胞粘连和细胞迁移，调节胚胎发育过程，促进细胞外基质的形成，促进创伤愈合，参与对免疫抑制及对炎症反应的调节等。近年来的研究表明TGF-及其受体与肿瘤的发生、发展密切相关。,TGF-1是目前所知最强的血细胞增殖抑制因子，在造血细胞生长、增殖、分化及凋亡中起重要作用 。,本课题组前期研究发现，从早期造血干细胞、单个核细胞到终末期细胞如分化成熟的粒细胞及血小板均表达TGF
2、-1，提示内源性TGF-1是促进血细胞的分化、调亡的内在动力，进一步研究发现采用全反式维甲酸（ATRA）及AS2O3诱导HL60细胞分化、凋亡过程中伴有内源性TGF-1 mRNA表达上调、bcl-2表达下调，将p53基因导入HL-60、K562细胞，发现p53 基因在诱导 HL-60、K562 细胞凋亡的早期，内源性 TGF-1 mRNA 表达上调，且细胞分泌 TGF-1蛋白的水平有明显提高，为了证实上述假说，我们应用TGF-1反义siRNA ODNS抑制内源性HL-60细胞TGF-1表达，发现其能阻断ATRA及AS2O3诱导细胞分化与凋亡，同时伴bcl-2表达恢复。,我们前期研究还发现急性白
3、血病患者血清中TGF-1水平明显减低，经治疗获缓解后其水平恢复正常，复发患者TGF-1水平又降低，急性白血病原代细胞和细胞株培养上清TGF-1水平与正常细胞相比有明显下降。进一步将外源性猪TGF-1基因转染HL-60细胞，也证实可以抑制HL-60细胞增殖、诱导细胞凋亡，提示内源性TGF-1表达缺陷可能是导致白血病细胞凋亡受阻、过度增殖的原因。,以上研究不足：1、外源性TGF-1因子2、猪全长TGF-1基因3、瞬时转染,四环素调控系统是目前应用最为普遍的人工表达调控系统之一，该系统由三部分组成:转录调节子、四环素反应性启动子和四环素及其衍生物。转录调节子由大肠杆菌Tn10转座子的抗四环素操纵子的
4、阻遏蛋白( tetR)和转录活化蛋白(TA)或抑制蛋白 (TS)两部分组成;四环素反应性启动子包括可以和tetR结合的七个拷贝的操纵子序列及其下游的TATA盒、转录起始点三部分，最常用的启动子来自人巨细胞病毒即刻/早期启动子，四环素及其衍生物可以和TetR结合，应用于人和动物副作用较小，而且能够穿过胎盘屏障和血脑屏障，由于它的亲脂性，可以被动穿过真核细胞膜发挥作用。,一、含人全长TGF -1 cDNA真核表达载体pcDNA4- TGF-1的构建及 其双稳定转染HL-60细胞的筛选二、TGF-1基因修饰的HL-60细胞生物学特性研究 三、TGF-1定量表达对HL-60细胞裸鼠异种移植瘤作用的研究
5、,第一部份,含人全长TGF -1 cDNA真核表达载体pcDNA4- TGF-1的构建及其双稳定转染HL-60细胞的筛选,材 料 与 方 法,实验材料1、pcDNA3- TGF -1真核表达载体由复旦大学张农教授馈赠，来自pSP65- TGF -1(源于德国Dr,Odenthal博士)。2、其余实验材料分别购自： Invitrogen公司、 TaKaRa公司、 QIAGEN 公司、 Promega公司等生物试剂公司。,细胞株及培养条件,HL-60细胞为急性粒细胞白血病细胞株，为本研究所保藏，HL-60细胞培养于含10FBS的RPMI1640培养液中，在37，5CO2,饱和湿度条件下的CO2培养
6、箱中培养。,重组真核表达载体pcDNA4- TGF-1的构建,重组质粒的鉴定,1、阳性菌落的PCR 鉴定 2、重组质粒的酶切鉴定 3、重组质粒的测序,质粒转染及筛选实验方法,确定HL-60对Blasticidin及 Zeocin的敏感性,1、用含不同浓度的Blasticidin或Zeocin培养基2、每天观察细胞，每三天用含不同浓度Blasticidin及Zeocin培养液的更换培养液一次。3、以四孔细胞全部死亡的Blasticidin及Zeocin最低稀释浓度为筛选浓度。,细胞转染,1、 pcDNA6/TR质粒转染HL-60细胞并筛选抗性细胞克隆TREx-HL-60。2、pcDNA4TGF-
7、1质粒转染TREx-HL-60细胞并筛选抗性细胞克隆。,转染效率的测定,荧光表达的pIRES2-EGFP空载体转染后24h，调整细胞浓度，加细胞悬液于细胞计数板，荧光显微镜下观察发绿色荧光的转染阳性细胞，计算转染效率。转染效率=发绿色荧光的细胞数/细胞总数。,抗性细胞克隆的鉴定,1、增加抗生素浓度培养（达10倍筛选浓度）2、RT-PCR检测TGF-1 mRNA表达实验分为对照、低、中、高剂量4组（分别含Tet浓度为 0ug/ml,1ug/ml,10ug/ml,20ug/ml） 3、ELISA法检测细胞培养上清中TGF-1蛋白水平 实验分为6组（A、B、C、D、E、F组）分别含Tet 0ug/m
8、l、0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml、20ug/ml，100ug/ml。,结 果,PCR鉴定阳性菌落,酶切鉴定阳性菌落,重组质粒的DNA测序和同源性分析,抗生素筛选浓度,Blasticidin筛选浓度为2g/ml Zeocin筛选浓度为750ug/ml,瞬时转染效率,RT-PCR鉴定抗性细胞株,ELISA法检测抗性细胞株经Tet诱导后上清 TGF-1蛋白的变化,讨 论,转基因技术和基因疗法能被安全有效使用的关键在于基因表达能否被实时、定量地控制，最近几年已有一系列基因表达人工控制系统出现,其中最有效的方法是在转录水平上的控制，通过用特定药物或激素供给或移去目标基因上游部分的有效“
9、基因开关”,可以使外源基因的转录在准确的时间、一定的水平或特定的组织中准确地打开/ 关闭，这些成功的控制系统给出了可以准确地控制生物体外源基因表达的实用方法,并使基因治疗的广泛应用成为可能。,本研究使用的pcDNA4/TO是一种可利用四环素调控的DNA载体，本实验通过酶切、提纯、质粒连接成功的将人的TGF -1上导入pcDNA4/TO ， 通过PCR鉴定、酶切鉴定出的阳性菌落，最后经过测序鉴定证实均已将人的TGF -1上插入pcDNA4/TO质粒载体中，鉴定结果显示连入方向有正向和反向。我们选定2号正向插入的阳性菌落进行DNA大量纯化而获得了可调控的pcDNA4- TGF-1质粒，随后进入下一
10、步的细胞转染。,细胞转染技术,物理介导（电穿孔法 ）生物介导（病毒介导的转染技术 ）化学介导（脂质体转染方法 ）,我们还应用RTPCR和ELISA检测法鉴定了抗性双转染单克隆细胞，在不同浓度诱导剂培养基中检测了转基因TGF1HL60细胞的TGF-1 mRNA和蛋白的表达， 检测结果表明了载体pcDNA6/TR和pcDNA4 TGF-1双转染的TGF1HL60细胞在一定浓度诱导剂的作用下可上调目的基因TGF-1表达，并且表达量与诱导剂Tet浓度正相关，鉴定结果提示我们筛选得到的是所需的单克隆细胞株。本实验的意义在于我们得到了能够通过诱导剂自由地定量调控表达TGF-1的细胞株TGF1HL60 ，为
11、进一步研究TGF-1的对白血病的作用机制提供了更可靠的手段。,第二部分,TGF-1基因修饰的HL-60细胞 生物学特性研究,材 料 与 方 法,实验材料 蛋白提取液购自PIERCE公司；MTT、 DEPC、ATRA购于Sigma公司；流式细胞仪凋亡检测试剂盒（ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I）、TUNEL试剂盒（Dead End TM Colorimetric TUNEL System）为Promega公司产品；细胞周期检测试剂盒购自北京天来公司；CD33、CD11b抗体购自BECKMAN COULTER公司；兔抗人TGF1、-actin、Bax
12、、C-myc、bcl-2单抗购自Ebioscience公司；辣根标记山羊抗兔IgG购自北京中山生物技术公司；0.1%NBT- TPA丙酮溶液购自Fluka公司；余同第一部分。,分 组,实验分为五组：A组: 阴性对照组 0ug/ml Tet TGF1-HL60细胞 B组：四环素对照组 20ug/mlTet HL-60细胞 C组：低剂量组 0.8ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 D组：中剂量组 4ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 E组：高剂量组 20ug/ml Tet ， TGF1-HL60细胞,细胞增殖实验,细胞生长曲线（MTT法） 集落形成抑制试验,细胞凋亡实验,1、细
13、胞DNA片段化检测 2、TdT酶介导的原位缺口标记(TUNEL法) 3、Annexin-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡 4、 DNA倍体分析及细胞周期分析,细胞分化实验,实验分为六组：A组: 阴性对照组 0ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 B组：四环素对照组 20ug/ml Tet, HL-60细胞 C组：阳性对照组 ATRA 1uM ，TGF1-HL60细胞 D组：低剂量组 0.8ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 E组：中剂量组 4ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 F组：高剂量组 20ug/ml Tet ， TGF1-HL60细胞,细胞分化实验
14、,1、细胞形态学检查 2、NBT 还原试验（比色法）3、流式细胞术检测细胞表面CD33、CD11b抗原表达,RTPCR测定凋亡相关基因 mRNA表达,Western blot 测定凋亡 相关蛋白表达,TGF-1C-mycBcl-2Bax,提取蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗、二抗孵育显色,结 果,细胞生长曲线,集落形成抑制试验,细胞凋亡,TUNEL检测结果,C组：5.9% D组：15.8% E组：21.7%,Annexin-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡结果,C组：12.6% D组：16.0% E组：20.7%,DNA倍体分析及细胞周期分析 检测结果,细胞分化,NBT 还原反应实
15、验,转染细胞表面CD33、CD11b抗原表达,凋亡相关基因的表达,凋亡相关蛋白表达,讨 论,TGF-1是最重要的造血负调控因子之一, TGF-1对白血病细胞有直接的抑制作用，这种抑制作用与它引起的细胞凋亡有关。,我们成功利用Tet-on系统将外源性人全长 TGF - 1 cDNA 导入HL-60 细胞，并筛选得到能调控表达TGF - 1的单克隆细胞株TGF1HL60，本实验进一步研究了不同浓度诱导剂Tet对双稳定转染细胞TGF1HL60生长增殖、分化、凋亡的影响，实验发现经Tet诱导产生的TGF - 1高表达可抑制HL-60细胞增殖，诱导其凋亡，经诱导产生的TGF - 1还有促进诱导细胞分化作
16、用，增加HL-60表面CD11b的含量。CD33、CD11b抗原是髓系细胞的特异分化抗原，随着细胞的分化成熟， CD33的表达下降而CD11b的表达上升,说明诱导产生的TGF - 1还有促进细胞分化作用，由于在单克隆细胞上进行的研究，更有说服力。,为进一步探讨这种作用的机制，我们利用半定量RT-PCR及Western Blot检测了TGF - 1 、Bcl-2、c-myc、hTERT、 Bax、fas等基因和/或蛋白，观察上述基因及蛋白表达水平的变化，结果观察到通过Tet诱导，转染细胞随着TGF - 1 mRNA 水平表达增高， bcl-2、fas、c-myc 、hTERT mRNA 表达的下
17、降，而Bax表达量却增加 。,第三部分,TGF-1定量表达对HL-60细胞裸鼠异种 移植瘤作用的研究,材 料 与 方 法,1. 药品与试剂 依托泊甙（VP16）购自上海华联制药有限公司产品； 余同第一部分。 2. 动物及细胞株6-8周龄的BABL/C裸鼠，体重16-18克，雌性，由中国医学科学院上海实验动物繁育中心提供，为无特殊致病菌（SPF）动物，合格证号为SOXK（沪）2003-0003。,实验分组及给药方案,实验分为六组：(腹腔注射）A组: 阴性对照组 0ug/ml Tet， TGF1-HL60细胞 B组：四环素对照组 10mg/kg Tet , HL-60细胞 C组：阳性对照组 VP-
18、16 4mg/kg，TGF1-HL60细胞 D组：低剂量组 0.4mg/kg Tet， TGF1-HL60细胞 E组：中剂量组 2mg/kg Tet， TGF1-HL60细胞 F组：高剂量组 10mg/kg Tet ， TGF1-HL60细胞,检测指标,1、体重变化 2、肿瘤体积变化及瘤重抑瘤率计算 抑瘤率（IR）（1实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）100% 3、血常规及肝肾功能4、组织病理观察 5、透射电镜观察,结 果,肿瘤体积生长,透射电镜的观察结果,瘤块病理组织学检查结果,荷瘤裸鼠心、肺、肝、脾、 肾病理学检查结果,讨 论,随着医学的发展与进步，急性白血病的治疗水平也有了很大提高，人们不
19、仅仅满足于病人的完全缓解，而致力于最终使病人长期无病存活乃至痊愈的研究，目前白血病的治疗方法有化疗、中西医结合治疗、骨髓移植、生物调节剂治疗、基因治疗等方面。化疗和骨髓移植作为治疗白血病的重要方法已被广泛应用,但化疗和骨髓移植同时也带来很多并发症,并且复发率很高 ，近年来，白血病的靶向治疗，基因治疗、白血病细胞疫苗、细胞因子越来越引起重视，自体或异体来源的肿瘤细胞灭活后联合卡介苗、干扰素或粒-巨噬细胞集落刺激因子等佐剂，可延长患者的生存期。,细胞因子网络的稳定是维持造血系统内环境稳定的关键因素之一，但细胞因子网络失衡在白血病的发病机制中的作用目前仍不明确。目前的化疗使白血病患者的生存率得到明显
20、的改善，而细胞因子作为化疗的辅助手段使患者的生存率得到进一步的提高。由于化疗对正常细胞的毒性作用以及白血病细胞耐药性的增加， 目前认为细胞因子辅助应用于白血病的治疗是较有前景的方法之一。,本实验结果显示：诱导剂诱导产生内源性TGF-1对裸鼠异种移植瘤的生长具有明显抑制作用，它能延长移植瘤的成瘤时间，将裸鼠成瘤时间延长一到二天，也能抑制移植瘤的生长，抑瘤率分别达到20.7%（低剂量组）、30.9%（中剂量组）与58.0%（高剂量组），提示这种作用与诱导剂的浓度成正比，从实验结果显示单纯的诱导剂本身没有抑瘤作用，我们认为诱导剂Tet是通过诱导转染细胞内源TGF-1高表达而产生抑瘤作用的。在给药期间
21、观察裸鼠一般状况，未发现诱导剂有明显毒副作用，经检测裸鼠血常规及血肝肾功能，以及心、肺、肝、脾、肾等重要脏器病理检查，亦未发现Tet对以上重要脏器有明显的损害，说明在实验剂量下Tet毒副作用不大，能用于机体研究。,结 论,1. 本研究成功的构建含hTGF-1的pcDNA4/TO 真核表达载体，通过PCR鉴定、酶切鉴定并最终经测序确认，命名为pcDNA4 TGF1。2. 成功地建立了以重组可调控真核表达载体pcDNA4- TGF1及pcDNA6/TR双转染的HL-60单克隆细胞株，命名为TGF1HL60细胞 。,3. 以TGF1HL60细胞为研究对象，通过添加不同剂量诱导剂Tet上调转染细胞TG
22、F-1表达量，进一步证实了TGF-1可抑制HL-60细胞增殖、促进HL-60细胞分化和诱导细胞凋亡；采用半定量RT-PCR及Western-Blot方法研究发现， TGF-1能通过上调bax 基因及蛋白表达，下调bcl-2、c-myc、fas、hTERT等凋亡相关基因及蛋白表达，从而诱导细胞凋亡。4. 体内实验发现通过腹腔注射诱导剂Tet可以影响TGF1HL60细胞裸鼠异种移植瘤的生长，抑瘤率分别达到20.7%（低剂量组）、30.9%（中剂量组）与58.0%（高剂量组）。,致 谢,本课题是在尊敬的导师陈元仲教授的悉心教导、全力支持和热情关怀下完成的。在课题的选题、设计、实施和论文的撰写过程中倾
23、注了导师无尽的心血。在此谨对老师辛勤的培养和悉心的关怀表示深深的敬意和由衷的感谢！整个课题研究是在福建省“211工程”重点实验室福建省血液病研究所完成，得到全体临床、医技和科研人员的耐心指导和热情帮助。感谢血研所吕联煌教授、陈志哲教授、胡建达教授、沈建箴教授、王少元教授、张学敏教授对我的鼓励和指导。感谢复旦大学张农教授的无私帮助，感谢福建医科大学许建华教授、 刘合焜教授给予的指导和帮助。感谢吴勇博士、黄美娟博士、黄慧芳博士、肖义军博士、李乃农博士、邹起练博士、陈彩萍博士、陈鑫基博士、 骆社丹博士、陈建华博士、郑静博士、郑志宏博士、黃豪博硕士、郭江睿硕士、刘霞硕士、俞萍丽硕士、陈显凌硕士、陈小芳硕士、范丽萍硕士、陈英玉硕士、李景冈硕士 、杨月玲副主任技师、林振兴秘书、张臣青主管技师、林锦娟技师、张昭秀技师给予实验技术上的指导、物质上的支持和精神上的鼓励。借此机会，我要特别感谢我的家人给我的理解、关怀和无私的支持。,
