1、化学物及 代谢物,分离纯化,监控,兽药等化学物,样品,检测方法,快速检测方法 仪器确证方法,固相萃取技术 基质固相分散技术 免疫亲和色谱技术 分子印迹技术 超临界萃取技术,四、有害化合物残留检测技术,微生物抑制测定法 酶联免疫吸附测定法 量子点标记荧光检测法 荧光偏振免疫检测法 化学发光免疫检测法 放射免疫测定法 金标试纸条 生物传感器 生物芯片,1、快速检测方法,荧光偏振免疫分析技术,荧光偏振免疫分析（Fluorescence polarization immunoassay，FPIA）是竞争性的均相免疫分析方法，就是检测荧光标记抗原（tracer）在结合特异性的抗体前后，荧光偏振值（FP）
2、值的变化，不需要分离结合的和未结合的抗体，经过几分钟甚至是几秒钟的温育便可直接测量，很快得到被测药物的浓度，实验的时间仅仅决定于加样的时间,FPIA 是竞争性的均相免疫分析,抗原浓度低 FP值高,抗原浓度高 FP值小,P,荧光素与磺胺二甲基嘧啶偶联,SM2-FITC,TLC分离纯化,双抗夹心TR-FIA反应原理示意图,氯霉素 莱克多巴胺,化学发光免疫分析技术,化学发光免疫分析（CLIA），一般分为两种模式。第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性；第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量,Cl-ELISA 与传统ELISA灵敏
3、度比较,Cl-ELISA,ELISA,Development of a Chemiluminescent ELISA for Determining Chloramphenicol in Chicken Muscle， Journal of Agriculture Food and Chemistry, 2006, 54 (16), 57185722,化学发光免疫检测氯霉素,量子点标记免疫分析技术量子点(quantum dots，QDs)又称半导体纳米微晶体，是一种由II-VI族或-V族元素组成的，直径约为1-100nm，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，量子点表面结构经过修饰，借助于其
4、外端的羧基，能与生物分子的氨基相结合，如抗体等偶联,2、仪器分析方法,气相色谱法（GC） 高效液相色谱法（HPLC） 原子荧光法(AF) 原子吸收法(AA) 气谱-质谱法（GC-MS） 气谱-串联质谱法（GC-MS/MS） 液谱-质谱法（LC-MS） 液谱-串联质谱法（LC-MS/MS）,各种测定方法的灵敏度范围,有害化合物残留检测：先用快速检测产品进行筛查，可疑阳性样品再用仪器分析方法尤其是色质联用检测方法加以确证。,美国、欧盟、日本等均采用此策略，抽检数量超过总样品数的10%！,1、快速检测产品种类,试剂盒 试纸条 生物传感器 免疫芯片 快速检测仪 检测箱,目前主要的快速检测产品包括:,五
5、、快速检测产品研制,2、小分子抗体制备技术,目前抗体种类主要是多抗和单抗 替代抗体：基因重组抗体、纳米抗体、核酸适配体、抗转运蛋白、受体、分子印迹聚合物等均有相关研究,核酸适配体,抗转运蛋白,兽药分子量大都小于1000，药物本身没有免疫原性，必须经过结构改造后与大分子载体蛋白结合才能产生有效抗体,半抗原,信息含量丰富的半抗原合理设计,小分子,结构优化,计算化学,性质参数（物化、电量、空间等信息）,最佳半抗原,免疫动物,抗体,合适抗原表位,间隔臂,最佳半抗原,统计分析,应用量子力学AM1，得到了磺胺类和玉米赤霉醇类药物的物化、电性、疏水性等性质，从分子水平比较各药物与半抗原的异同（化学学报，20
6、08，66，2613-2619）。为半抗原合理设计提供了方法指导,SM2化学结构,SM2最低能量构象,SM2最高占据轨道（HOMO）和最低未占据轨道（LUMO）,玉米赤霉醇类药物的三维构象和电荷分布,玉米赤霉醇类药物的结构信息,Z H Wang， J Z Shen. 2009. Journal of Molecular Recognition, submitted.,疏水性,体积,偶极距,分子距离,电量,相关系数,获得的分子结构信息，已用于半抗原的合理设计,单 克 隆 抗 体 制 备 过 程,脾细胞,杂交瘤细胞,基因重组抗体制备,噬菌体展示抗体库淘选策略,scFv,抗体评价及指导抗体定向改造,
7、受体抗体（Acceptor）,UniSenesor公司研发了基于受体的可同时检测13种青霉素和四环素两类药物的试纸条产品中国农大和北京维德维康公司合作研发可同时检测15种青霉素和头孢类药物的试纸条产品,受体作为特异性识别的生物大分子，因其分离纯化及体外构建均较复杂，应用于免疫分析的报道很少,Twin Sensor BT,放射性受体分析法 1978年美国波士顿大学教授Charm发明,受体分析法,C H A R M I 是专用于牛奶中一内酰胺抗生素残留 检测方法， 也是美国 A O A C承认的第一个快速测定 法， 这个方法非常快速和灵敏，一个奶牛样品分析 只需 1 5分钟时间,目前，CHARM被
8、多国政府的农业部和卫生部采用作为的标准方法 如我国: 四环素类（SN/T 2309-2009），-内酰胺类(GB/T 21174-2007)，磺胺类(GB/T 21173-2007),细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而引起生物学效应的特殊蛋白质,微孔板检测系统 基于膜的检测系统 表面等离子共振传感器,侧流层析技术,免疫渗滤技术,荧光分析系统,CHARM原理,受体分析法的优势：可以检测同一类抗生素 难点：受体的制备,检测方法的应用,目的基因的调取,目的蛋白活性鉴定,目的蛋白的表达及纯化,表达载体的构建,基于受体的快速 检测方法建立,检测方法的优化,青霉素等-内酰胺类抗生素通过
9、与细菌膜蛋白结合，抑制细菌细胞壁的生物合成，引起细菌细胞死亡从而发挥杀菌作用的。这种细菌蛋白被命名为青霉素结合蛋白(Penicillin-Binding Protein，PBP)2001年发现了肺炎链球菌野生R6株5个编码明确的青霉素结合蛋白的基因，其中PBP 2x对青霉素类和头孢类抗生素都具有很高的敏感性,青霉素结合蛋白识别-内酰胺药物列表,基本原理 目前常用的主要为ELISA试剂盒。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体起反应，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本
10、中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,（1）试剂盒,3 、试剂盒、试纸条研制,1、加入待测物；2、加入抗体；3、加入酶标二体；4、加入底物；5、加入终止液,目前试剂盒最常用方法为间接竞争ELISA法，其他还用直接法、夹心法等。,优点 灵敏度高，特异性强，可进行定性和定量测定 检测方便、快捷，一般1-2个小时就能出结果 对操作者和实验室条件要求不高 可以用于大量样本的快速筛选,试剂盒组成,试剂盒检测需要的仪器,恒温摇床,离心机,恒温培养箱,涡动仪,酶标分析仪,移液枪,试剂盒检测所需试剂,主要用于复杂样品（如肌肉、肝脏等）的前处理。大多为常规有机或无机溶剂， 1、甲醇 2
11、、乙腈 3、乙酸乙酯 4、磷酸盐缓冲溶液 5、,由低到高的标准溶液，用于绘制标准曲线,阳性添加样品孔,阴性添加样品孔,实测样品区，最多可检测40个样品,酶标板实际检测布局,试剂盒一般操作步骤,1、向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液，再加入一抗，用盖板膜封板，37恒温箱中孵育； 2、倒出孔中液体，加入浓缩洗涤液，30 s后倒出孔中液体，如此重复操作，用吸水纸拍干； 3、加入酶标二抗，37恒温箱中孵育； 4、倒出孔中液体，重复洗涤步骤； 5、加入底物显色液A液，底物显色液B液，轻轻振荡混匀，37恒温箱避光显色15 min； 6、加入终止液，轻轻振荡混匀； 7、用酶标仪，测定每孔吸光度值。,以检
12、测标准浓度(g/L)的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度(g/kg)可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。,1,试纸条结构,基本原理 采用竞争法，样品滴入后，在层析作用下经胶体金标记抗体的结合垫，再流经包被抗原和二抗的T线和C线，若样品中含有药物，药物与金标抗体结合后不再与抗原反应，T线不显色；若不含药物，则金标抗体与抗原反应，T线显色；无论有无药物，二抗与金标抗体均反应，即C线显色。,（2）试纸条,优点 灵敏度高，特异性强 检测方便、快捷，一般3-5分钟就能出结果 几乎不需要任何仪
13、器设备 可用于大量样本的快速筛选，适用于现场检测,试纸条组成,试纸条的一般检测步骤,1、样品前处理 对牛奶、蜂蜜、尿液等样品，只需进行简单稀释即可； 对猪肉等样品，通过提取或加热处理后，进行稀释； 2、取出试纸条，平放到桌面上，用一次性吸管吸取样品处理液，在加样孔中加入4滴； 3、5 min后观察结果； 4、结果判定。,阴性：C线显色，T线有颜色，无论颜色深浅均判为阴性。 阳性：C线显色，T线无颜色，判为阳性。 无效：C线不显色，无论T线是否有无，该试纸条均判为无效。,结果判定,4、生物传感器、生物芯片研制,原理： 待测物质经扩散作用进入生物活性材料，经分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而
14、被相应的物理或化学换能器转变成可定量和可处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，便可知道待测物浓度。,生物传感器,免疫传感器可以实现在线化和即时化，目前应用于小分子化合物检测的主要是光学生物传感器-表面等离子体谐振（SPR）传感器 ，由瑞典BIACORE公司研制,生物芯片,来自计算机芯片，不过10年 近百家公司从事相关工艺、设备、检测手段、软件开发 实质上是传感器分析的组合 阵列检测可大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性 蛋白（抗体）芯片-基于免疫反应,兽药残留蛋白芯片检测原理图,芯片是传感器分析的组合，实现了集成化，可并行检测，一次可以检测成千上万的样本 传感器和芯片技术是目前快速检测技术研究的制高点，也可能是未来快速检测的主流技术,六 展望,残留检测先用快速检测产品进行筛查，可疑阳性样品再用色质联用检测方法加以确证是主线 快速检测技术实现在线化、并行化，目前主导产品是试剂盒和试纸条,试纸条是发展方向,传感器和芯片技术也许是未来的主流技术 半抗原设计信息丰富化 抗体的特性呈现灵敏化、广谱化，种类呈现多样化、微型化 近期多抗和单抗依然占主导地位，长远来看，新型抗体必将取代传统抗体,二、研究方向,兽药残留检测技术（包括快速检测产品研发） 分子毒理学 动物及动物性食品中病原生物耐药性产生与扩散及风险评估 兽药环境生态毒理学 新兽药创制,谢 谢大家！,
