1、丹参诱导鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞优化方案及电生理研究胡琳燕 1 余加林 1 刘官信 1，2 陈波曼 3 李芳 1 李禄全 1 钟海英 1，2摘要：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)，采用丹参对 45 代 MSCs 进行反复多次诱导分化及再分化，将其诱导分化为神经样细胞，倒置显微镜下连续观察形态学变化，通过免疫荧光细胞化学检测神经样细胞巢蛋白(nestin） 、神经丝蛋白 (neurofiliament, NF） 、突触小泡蛋白(synaptophysin) 的表达，采用细胞膜电位特异的荧光探针 DiBAC4(3)标记细胞，激光扫描
2、共聚焦显微镜动态监测细胞受高钾刺激前后的荧光强度变化，观察细胞电生理反应。结果显示：MSCs 第 1 次经过丹参诱导 2 h 后，MSCs 伸出突起，向神经性细胞形态转变，此时 nestin 表达率为 (95.12.1)% （ s, n=3），基x本不表达 NF；随着诱导分化及去分化过程的次数增加，细胞分化为神经样细胞的时间缩短，突起拉长并交互缠绕呈复杂网状，MSCs 第 4 次经过丹参诱导 1 h后，NF 表达率(95.31.6)% ( s, n=3)，并表达 Synaptophysin，5 h 后xSynaptophysin 表达更为广泛；激光共聚焦扫描显微镜显示第 4 次诱导 5 h 后
3、的细胞在高钾刺激下发生去极化，胞内荧光强度瞬时增强，而 MSCs 空白对照对高钾刺激无反应。本优化诱导方案可以高效率地诱导 MSCs 分化为具有电生理特性的神经样细胞。关键词：骨髓间充质干细胞；丹参；神经性分化；优化方案；电生理特性骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) 定向诱导分化是近来研究热点。MSCs 属多能干细胞，具自我更新和多向分化潜能，一定条件下可分化为神经细胞。本课题研究小组前期已证实丹参注射液可诱导 MSCs 分化为神经样细胞，但诱导条件也即细胞的生存条件比较单一，以致细胞不能长期存活，诱导 8h 就可见明显的细胞漂浮死亡，尽管此时的细胞表
4、达神经特异性烯醇化酶(NeuN) 1，但体外培养的神经元成熟时间是 914 天 2，因此仅仅诱导 8 h 的神经样细胞无法表现出兴奋性生理特性。近来本研究小组发现同样以这种单一的收稿日起：2007-09-29 ， 接收日期：2008-02-03国家中医药管理局（国中医药函 2007223 号）NO.2006LHR09，重庆市教育委员会（渝教科 2006 8 号）NO. KJ060303, 重庆市卫生局（渝中医2004 12 号）NO. 2004-B-66通讯作者：Tel：023-63635567, email: , 重庆医科大学附属儿童医院：1 新生儿科，2 儿科医学研究所中心实验室，重庆，
5、4000143 浙江大学医学院附属妇产科医院新生儿科，杭州， 310006诱导条件，即含有 60 mg/L 丹参及 10 ng/mL 碱性成纤维生长因子 (basic fibroblast growth， factor, bFGF) 的无血清培养基，经过反复多次诱导后神经样细胞表现出兴奋性神经细胞的特性，本文就报道上述结果：1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 清洁级 4 周龄 Wistar 大鼠，雌雄不限，购自第三军医大学大坪实验动物中心合格证号：SCXK（渝）20020003 。1.1.2 主要试剂 DMEM/F12 培养基（美国 Gibco） ；胎牛血清（澳大利亚 PAA） ；
6、重组人碱性成纤维生长因子（bFGF） （美国 PeproTech） ；丹参注射液（1.5g/ml正大青春宝） ；DiBAC4(3) (美国 Biotium)；羊抗巢蛋白 (nestin)多克隆抗体（美国 Promega） ；小鼠抗 NF68KD/200KD 单克隆抗体，兔抗突触小泡蛋白(Synaptophysin)多克隆抗体（美国 Neomarkers） ； 兔抗羊 Cy3 荧光二抗，羊抗鼠 Cy3 荧光二抗，羊抗兔 Cy3 荧光二抗（美国 Sigma，武汉博士德公司分装） ；DAPI （美国 Roche） 。1.1.3 主要试剂的配制：丹参储备液的配制：取一支丹参注射液（10 ml/支）用1
7、5 ml 无血清DMEMF12培养液稀释为600 mg/L的储备液，4 保存；bFGF 储备液的配制：用pH 7.6、5 mmol/L Tris盐酸溶解稀释为10 mg/L 储备液，分装20 保存，临用时用无血清DMEMF12培养液稀释为10 g/L 临时储备液；诱导液的配制：丹参储备液和无血清DMEMF12培养液以1: 9混合，并追加bFGF临时储备液，使得丹参工作浓度为60 mg/L ，bFGF工作浓度为10 ng/L；荧光染料及高钾刺激液的配制：将DiBAC (3)溶于无水乙醇配成 5 mmol/L储备液，分装后4 保存。染色前用无血清的DMEM/F12 培养液稀释为 5 mol/L。将
8、KCl溶于5 mol/L DiBAC4(3)染液，配成250 mmol/L 高钾刺激液。1.2 方法1.2.1 MSCs 的培养 4 周龄 Wistar 大鼠（雌雄不限） ，断颈处死，无菌条件下分离股骨和胫骨，骨髓冲洗液离心后用含 10%胎牛血清的培养基重悬，接种于培养瓶中，置于 37 、5% CO2 湿饱和恒温培养箱培养 48 h 后首次换液，以后每23 天换液一次，细胞达 80%90%汇合后 0.25% 胰蛋白酶消化传代，取 45代状态良好的细胞进行实验。1.2.2 细胞的诱导分化 将细胞接种在预先放置了消毒盖玻片的六孔板内，待细胞达 60%70%汇合时加入含 10% FBS 及 10 n
9、g/ml 的 bFGF 的培养基预诱导 24 h，更换为诱导液（含 60 mg/L 丹参和 10 ng/ml bFGF 的无血清培养基）诱导 2 h，加 10% FBS 进行去分化，约 24 h 后再次更换诱导液诱导 3 h，如此重复45 次，且每次诱导时间都较前延长 1 h，每次诱导 12 孔，分别用来进行检测3 种抗体及膜电位测定。方法如图 1 所示： 去 分 化24 h去 分 化24 hMSCs接种 于 无 菌盖 玻 片 上 培 养12天 预 诱 导 液 (含10% FBS和 10 ng/ml bG) 诱 导 液 (含60mg/L 丹 参 和1 nl bFG)诱 导 2h去 分 化 培
10、养 基(含 60 mg/L丹 参 , 1 n/l bFG和 0% BS)预 诱 导24 h 第 1次 诱 导 诱 导 液诱 导 4 h 去 分 化培 养 基去 分 化培 养 基 去 分 化 24 h诱 导 3 h诱 导 液 第 2次 诱 导第 3次 诱 导诱 导 5 h 诱 导 6 h去 分 化 24 h去 分 化培 养 基诱 导 液 诱 导 液 终 止 ， 进 行 检 测第 5次 诱 导第 4次 诱 导 去 分 化去 分 化接种 于 无 菌盖 玻 片 上 培 养 天 预 诱 导 液 含和 诱 导 液 含丹 参 和 诱 导 去 分 化 培 养 基含 丹 参和预 诱 导 第 次 诱 导 诱 导
11、液诱 导 去 分 化培 养 基去 分 化培 养 基 去 分 化 诱 导诱 导 液 第 次 诱 导第 次 诱 导诱 导 诱 导去 分 化去 分 化培 养 基诱 导 液 诱 导 液 终 止 ， 进 行 检 测第 次 诱 导第 次 诱 导图 1 丹参诱导 MSCs 分化为神经样细胞流程图1.2.3 免疫荧光细胞化学 将诱导后的细胞爬片用 0.01 mmol/L PBS 洗去诱导液，预冷纯丙酮固定，PBS 洗 3 次，正常山羊血清室温下封闭 30 min，甩去多余血清，一抗 4 C 反应过夜，PBS 洗 3 次，荧光二抗室温下反应 45 min，PBS 洗3 次，DAPI 染核室温下 10 min ，
12、PBS 洗 3 次，片干后 50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。阴性对照以 PBS 代替一抗。1.2.4 膜电位检测 取未经诱导的 MSCs 和 4 次诱导 1 h 的细胞，弃去培养板内的诱导液，用无血清的培养液洗 3 次，滴入 0.4 ml 5 mol/L 膜电位敏感荧光探针DiBAC4(3), 37 C 下孵育 20 min，使染料达到质膜内外的平衡，保留染液直接在激光共聚焦显微镜检测膜电位。将爬片置于载物台上，对 DiBAC4(3)标记的具有神经细胞形态的细胞扫描 30 s，以此时的荧光值作为静息膜电位，然后向玻片中加入 100ul 250 mmol/L KCl，使 KCl 的刺激浓度
13、为 50 mmol/L，继续扫描，以观察膜电位的变化。摄像后使用生理学软件分析膜电位的变化。2 结果2.1 MSCs 的培养首次换液后，可见散在的细胞集落，细胞呈长梭形，成纤维样，78 天细胞基本铺满瓶底，呈漩涡状生长。传代细胞 23 天可铺满瓶底，漩涡状生长，分布均匀。2.2 MSCs 的诱导分化加入预诱导液 24 h 内，细胞形态未见明显改变（图 2） 。更换含 60 mg/L 丹参及 10 ng/ml bFGF 无血清培养基诱导后在倒置显微镜下观察，诱导 2 h 可见细胞胞体收缩，折光性增强，并伸出突起，向神经性细胞形态转变，多数为双极细胞且突起较短（图 3） 。在每一次诱导过后加 10
14、% FBS 去分化后，神经样细胞在短时间内即转变为成纤维样形态 ，随着诱导次数的增加，细胞转变为神经样形态速度加快，且细胞伸出的突起逐渐延长且相互交错呈复杂网状（图 4） 。图 2 MSCs 经 bFGF 预诱导24 h 的细胞细胞呈梭形，成纤维样（倒置显微镜, 400 ）.图 3 MSCs 第 1 次经丹参诱导2 h 后的神经样细胞细胞伸出突起，多呈双极（倒置显微镜, 400 ）.图 4 MSCs 第 5 次经丹参诱导6 h 后的神经样细胞胞体缩小，突起拉长互相缠绕形成复杂网状。（倒置显微镜, 400 ）.2.3 免疫荧光细胞化学检查第一次诱导 2 h 后，测神经元巢蛋白（nestin, 神
15、经干细胞特异性表面标志） ，表达率高达(95.12.1)% ( s, n=3)，但基本不表达神经微丝蛋白（neurofilament xprotein, NF，成熟神经元表面标志） ；四次诱导 1 h 后即表达 NF（图 5）及突触小泡蛋白（成熟神经元表面标志） （图 6） ，表达率均在(95.31.6) % ( s, n=3)，x四次诱导 5 h 后突触小泡蛋白更为广泛（图 7） 。图 5 MSCs 第 4 次经丹参诱导1h 后的神经样细胞 NF 表达阳性。蓝色为 DAPI 标记的细胞核，红色为 Cy3 染色，标记 NF （免疫荧光 , 400）.图 6 MSCs 第 4 次经丹参诱导 1
16、h 后的神经样细胞突触小泡蛋白表达阳性。蓝色为 DAPI 标记的细胞核，红色为 Cy3 染色，标记突触小泡蛋白（免疫荧光 , 400）.图 7 MSCs 第 4 次经丹参诱导 5 h 后的神经样细胞突触小泡蛋白表达阳性，其表达更为广泛。蓝色为 DAPI 标记的细胞核，红色为 Cy3 染色，标记突触小泡蛋白（免疫荧光, 400）.2.4 膜电位检测DiBAC4(3)是亲脂性膜电位敏感荧光探针，根据其在细胞内外及线粒体内外重新分布来判断细胞膜电位(membrane potential, MP) 的变化，荧光增强时表示细胞去极化。加入高浓度 KCl 后，神经样细胞和 MSCs 反应完全不同。神经样细
17、胞表现受到高钾刺激后胞内荧光强度瞬时增强（图 8） ，而 MSCs 未发生任何变化（图 9） ，导入分析系统后可见 KCl 引起的瞬时变化，神经样细胞的胞体及突起的膜电位变化曲线发生瞬时陡升。图 8 MSCs 经 4 次诱导分化 1 h 的神经细胞受高钾刺激后的膜电位变化。细胞受到高钾刺激后，胞内荧光强度瞬时增强。A 为刺激前的荧光图象，B 为刺激后的荧光图象，C 为经图像分析后的荧光强度变化趋势图（横坐标为时间变量，纵坐标为荧光强度变量）图 9 MSCs 受高价刺激后的膜电位无反应。D为刺激前的荧光图象，E 为刺激后的荧光图象，F 为经图像分析后的荧光强度变化趋势图（横坐标为时间变量，纵坐标
18、为荧光强度变量）3 讨论MSCs在不同实验条件下都可以分化为神经组织样细胞，目前诱导MSCs神经性分化有细胞因子法和抗氧化法。Sanchez-Ramos等 3将骨髓细胞暴露于添加有脑源性神经生长因子（BDNF） 、视黄酸（RA）以及表皮生长因子（EGF）的N5神经细胞培养基中12周后， NeuN及星形胶质细胞纤维酸性蛋白（ GFAP）的表达率分别为0.5%和1%，与胚胎中脑细胞共培养2周后，NeuN及GFAP的表达率分别为2%5%和5%8%。 Deng等 4用IBMX/dbcAMP诱导MSCs分化6天后，神经性分化率约为25%。Woodbury等 5使用-巯基乙醇和丁羟茴醚可短时内诱导MSCs
19、 分化为神经样细胞，分化效率约80%。这些通过细胞因子及化学因子的诱导方法需经过数天甚至更长的时间才能诱导出神经样细胞，神经性分化效率亦低，且后经证实这些神经样细胞并不具神经细胞生理特性 6。本课题组在前期工作中采用中药丹参结合bFGF诱导MSCs神经性分化，这种方法可以在短时间内（12 h）即可出现神经样细胞，诱导率在80%左右，由于诱导条件也即细胞的生存条件单一，8 h后即出现漂浮细胞（细胞发生凋亡坏死），因而难以获得电兴奋性神经细胞。在以同样的单一诱导环境下，采用短时多次诱导方案，即经过分化去分化分化的几次循环后，神经样细胞趋向成熟。形态上，经一次诱导的细胞多呈双极，突起较短形成简单的网
20、状，经过多次（5次）诱导的细胞呈多极，突起长而互相交织缠绕呈复杂网状。免疫荧光细胞化学显示4次诱导1 h后细胞即表达NF及突触小泡蛋白。本研究采用激光共聚焦显微镜对膜电位敏感荧光探针DiBAC4(3)进行荧光激发，此方法与全细胞膜片钳技术相比，时间分辨较差，不能提供毫秒级的变化资料，但全细胞膜片钳通常破膜后易产生漏电阻，使得细胞的膜电位低下，甚至不能成功诱发去极化，采用DiBAC4(3)可以在不损伤细胞膜的基础上更精确、更便捷地反应细胞的膜电位变化趋势。张宏伟等 7通过全细胞膜片钳分析了MSCs分化前后K +通道的变化，分化前的MSCs存在表达较弱的外向延迟整流K +电流以及内向整流K +电流
21、，随着神经性分化时间的延长，两种K +电流逐步增强， K+通道也趋向成熟，向兴奋性细胞方向分化。这说明由于MSCs的钾离子通道不成熟，不能被高浓度KCl所激活，当其分化成熟才能被高钾激活去极化以产生动作电位。本研究结果与其相吻合，当高浓度KCl刺激MSCs后，由于细胞不发生去极化，荧光强度在受刺激前后未发生变化，当刺激诱导后的神经样细胞，细胞迅速去极化，摄取阴离子性的DiBAC4(3)，使之与细胞内成分结合，引起细胞内荧光强度急剧上升,该结果与Okada等 8所测结果相近。尽管本研究设计的诱导环境单一，但从形态学、免疫学以及电生理角度都证实了以该单一的诱导环境经反复多次诱导可高效快速诱导出能产
22、生兴奋冲动的神经样细胞。本研究中bFGF在MSCs的神经性分化中扮演着启动子的角色 9，丹参具有较强的抗氧化作用，在诱导环节中担当着操纵子的角色。经多次诱导能高效快速诱导MSC分化具有电生理特性的神经样细胞的机制还不清楚，曾在克隆羊“多莉”时期发现：一个细胞的遗传信息能被重新调序，体细胞能重新分化变成多能细胞。当将成体干细胞通常生活的微环境发生改变时，环境改变的信号激活了一种对新细胞形成所必需的新的遗传程序，导致成体干细胞的遗传信息重新调序。连续的分化及去分化几次循环，MSCs暴露的微环境经历着多次改变，可能导致控制MSCs神经性分化的基因逐步开放，从而使分化过后的细胞渐趋成熟，这一具体机制还
23、有待进一步研究。参考文献(References)1 李禄全等。 中华儿科杂志 ， 2005，43: 532 郑志竑等。 神经细胞培养理论与实践 ，北京: 科学出版社，20023 Sanchez - Ramos J et al. Exp Neurol, 2000, 164: 2474 Deng W et al. Biochem Biophys Res Comm, 2001, 282: 1485 D Woodbury et al. J Neurosci Res, 2000, 61: 3646 Lu P et al. J Neurosci Res, 2004, 77: 1747 张宏伟等。 中华神经
24、医学杂志 ，2004, 3: 3248 Junichi Okada, et al. In J Biochem Cell Bio, 2005, 37: 13689 Chen J, et al. Brain Res, 2004, 1005: 21Study on Electrophysiological Function of Neuron-like cells Induced from Rat Mesenchymal Stem Cells by Salvia miltorrhiza with Optimized ProposalLin-Yan Hu, Jia-Lin Yu, Guan-Xin L
25、iu, Bo-Man Chen, Fang Li, Lu-Quan Li, Hai-Ying ZhongAbstract: Mesenchymal stem cells (MSCs) of rat were isolated and cultured, MSCs of passage 45 were induced to differentiate into neuron-like cells and dedifferentiate repeatedly. The process of differentiation was observed. Nestin, neurofilament (N
26、F) and synaptophysin were detected by Immunofluorecytochemistry staining to identify the differentiated cells and to calculate the differentiated rateMSCs and the neuron-like cells were labeled with voltage-sensitive fluorescent dye DiBAC4(3), 50 mmol/L Received: Sptember 29, 2007. Accepted: Februar
27、y 03, 2008.Supported by State Administration of Traditional Chinese Medicine of the Peoples Republic of China (NO.2006LHR09), Municipal Educational Commission of Chongqing (NO. KJ060303) and Chongqing Municipal Health Bureau (NO. 2004-B-66) Corresponding author: Tel: 86-023-63635567 email: Children
28、s Hospital, Chongqing Medical University, 1. Department of Neonatology, 2. Pediatrics Reseach Institute. Chongqing, 400014, China. 3. Department of Neonatology, Womens Hospital, School of medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310006, ChinaKCl acted as stimuli to evoke action potential, fluorescen
29、ce excitation of DiBAC4(3) was challenged by laser-scanning confocal microscope (LSCM) for the measurement of membrane potential (MP). The change of fluorescence intensity was observed and analyzed. In this study, MSCs began contracting and extending processes, changing its appearance into neurons a
30、fter 2hs of the first induction. However most of cells were monopole and dipolar. After 6hs of the 5th induction, the cells became multipolar and the processes stretched out and extended to form complicated net. Immunofluorecytochemistry presented that after 2hs of the first induction, the cells exp
31、ressed nestin only (with ratio of 95.12.1% ( s, n=3), but NF hardly. After 1h of xthe 4th induction, the ratio of NF expression rose up to 95.31.6% ( s, n=3) and xsynaptophysin was expressed, after 5hs of the 4th induction, synaptophysin expression was more extensive. The study of MP demonstrated th
32、e voltage-sensitive fluorescence of cells enhanced as soon as the cells were stimulated by high concentration KCl solution, and physiology chart showed the curve rose shapely, but MSCs which were not induced had no any response and the physiology chart showed the curve kept at horizon. It suggests Salvia miltorrhiza can induce MSCs to differentiate into neuron-like cells with electrophysiological properties efficiently and rapidly through optimized proposal.Key word: Mesenchymal stem cells; Salvia miltorrhiza; neurons differentiation; optimized proposal; electrophysiology
