1、一氧化碳中毒实验 和形态学综合实验技术,形态学中心实验室,目的和要求,1掌握形态学实验技术基本方法和技能 2. 掌握形态学科学研究手段和程序 3. 熟悉实验论文撰写的方法与步骤,实验技术路线,实验组 对照组 复 制 动 物 模 型 取材 石蜡包埋 切片HE染色 免疫组化染色 图像分析技术,复 制 动 物 模 型,实验内容,通过一氧化碳中毒实验,了解科研时动物模型复制基本方法; 通过HE染色,观察一氧化碳中毒对动物大脑皮质组织结构的影响; 通过免疫组化染色,观察一氧化碳对神经元内神经营养因子活性的影响; 通过图像分析,对免疫组化染色结果进行定量分析。,实验方法,1. 一氧化碳中毒动物模型复制 2
2、. 石蜡包埋技术 3. HE染色技术 4. 免疫组织化学技术,一氧化碳中毒实验,原 理,一氧化碳中毒,红细胞内血红蛋白与一氧化碳结合,而与氧结合能力降低,进而导致组织缺氧。 脑组织缺氧可导致脑体积增大,脑沟变浅,脑回增宽,切面见点状出血;小灶状坏死;神经元变性、坏死;小胶质细胞增生、肿胀、吞噬脂质而呈泡沫状等一系列病理变化。,操作步骤,1将动物分为2组, 把小鼠放入广口瓶内;,2实验组动物: 给予一氧化碳吸入, 待小鼠出现明显呼吸困难、 烦躁、晕厥时开瓶塞, 使小鼠苏醒; 对照组动物: 不吸入一氧化碳;,3第二天重复上述操作, 连续四天, 致小鼠急性中毒死亡。,4切开小鼠皮肤, 用咬骨钳打开颅
3、骨, 暴露脑组织;,5分离脑膜后,进行大体观察: 脑体积变化, 脑沟变化, 脑回变化, 有无出血、坏死灶;,6取出脑组织, 置于固定液,7. 石蜡包埋技术: 8. 分别染色: HE染色技术 免疫组化染色技术,石 蜡 包 埋 技 术,在显微镜下要观察人体组织,必须将组织切成以微米为单位的薄片,使其透光并易于观察,但直接切取柔软组织是难以办到的。,原 理,石蜡包埋法是将“支持物质”-石蜡渗入组织 内部,为此,必须先将组织中水分除净,用 酒精进行脱水(70809095l00)。 再用二甲苯或冬青油置换出组织中的酒精, 使其透明,然后放入融化的石蜡中。将浸蜡的 组织块置于包埋框中,冷却后组织块便具有石
4、蜡 的硬度,切片机便能将组织切成薄片。,三 操作步骤,1. 取材 直接取材或灌注后取新鲜组织 (不超过6h),切成352mm小块。 2. 固定 保持细胞原有形态和结构,解决组织 自溶问题。10中性甲醛、4多聚甲醛等。 3. 冲洗 自来水流水冲洗, 目的:停止固定液 对组织的作用,去除固定液,以免影响染色。,4. 脱水 通常多用酒精脱水,为减少组织收缩,脱水酒精的浓度必须由低浓度开始,逐级升高浓度。 60 (1h)70 (1h)80酒精(1h) 90 (1h)95I(1h)95II(1h) 100I (1h)100 II (30min)。 注意: 脱水的具体时间视组织块大小体积与厚度而定。,自动
5、脱水机,5.透明 透明剂常有二甲苯、冬青油等等。常用方法:1/2冬青油冬青油二甲苯洗涤。 6.浸蜡 将透明组织移入已熔化的石蜡中,使熔化的石蜡能浸透到组织中,然后包埋成组织蜡块。浸蜡过程在温箱中进行,温度不能超过60oC,温度过高或时间过长,组织容易收缩和脆变。 方法:1/2石蜡石蜡I石蜡II石蜡III。,7.包埋 将组织块和石蜡置于包埋框内,冷却即成蜡块,组织获得了一定硬度和韧度,就可以切成微薄的切片。,包埋机,8.切片 载玻片先用蛋白甘油处理; Leica切片机进行切片,厚5m; 45oC漂烘仪内进行展片。9.裱片10.烤片,切片机,HE 染色实验技术,苏木精(hematoxylin) :
6、 碱性染料 伊红(eosin):酸性染料,嗜碱性,嗜酸性,原 理,操作步骤,1、脱蜡:石蜡切片常规脱蜡至水 二甲苯 100酒精95酒精 80酒精 70酒精 蒸馏水。,2、苏木精染色:5 10 min,核染成蓝色。3、分色:0.5盐酸酒精分色,镜下控制。4、蓝化:自来水冲洗1 2h。,5、伊红染色:1-2 min,将胞质染成红色。6、分色:90酒精分色,镜下控制。,7、脱水:95酒精 100酒精 X 2 8、透明:二甲苯 X 29、封片:用中性树胶进行封片 。,免疫组织化学技术,免疫组织化学技术是根据抗原与抗体特异性结合的原理,检测组织中的肽和蛋白质的一种技术。 把人和动物的某种肽和蛋白质作为抗
7、原注入另一种动物体内,该动物便会产生针对抗原的特异性抗体。将抗体提取与标记物结合,即成为标记抗体。,原 理, 将标记抗体与组织切片孵育,抗体则与组织中相应抗原特异性结合,在显微镜下通过观察标记物而获知该肽或蛋白质的分布部位。 常用标记物有荧光素、辣根过氧化物酶、胶体金等。 酶标抗体的染色分直接法和间接法。,直接法 将酶直接标记在抗体上,再用标记抗体与样品中的抗原直接结合 。 该方法操作简便,但敏感性不及间接法。,直接法(A),间接法 将分离的抗体(第一抗体简称一抗)作为抗原免疫另一只动物,制备该抗体的抗体(第二抗体简称二抗),将酶标记在第二抗体上。先后以一抗和二抗处理样本,最后形成抗原-一抗-
8、标记二抗复合物。间接法中的一个抗原分子通过一抗和多个标记二抗相结合,因此它的敏感性较高。,间接法(B),抗生物素(avidin)又称卵白素或亲和素,是从卵白中提取出的一种糖蛋白,1个抗生物素分子与生物素( biotin )有4个结合位点, 两者有很强亲和力, 相互结合后形成 不可逆的复合物。,ABC法,在ABC反应中,用生物素分别标记抗体和过氧化物酶,抗生物素蛋白则可作为桥将生物素标记的抗体和生物素标记的过氧化物酶连接起来,形成一个很大的、网络有大量酶分子的复合物 。,抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidase complex method ,ABC
9、)的敏感性很强。,免疫细胞化学的最终显色反应是通过酶与底物作用生成不溶性色素而完成的,所选用底物与呈色反应密切相关。辣根过氧化物 酶(horseradish peroxidase, HRP) 过氧化氢 (底物) DAB (二氨基联苯胺)(电子供体)HPR+H2O2 HPR.H2O2+DH2(还原型供氢体)HPR+H2O+D(氧化型供氢体) 棕褐色沉淀。,ABC法染色结果,四、免疫组织化学ABC法染色过程,1) 脱蜡至水(石蜡包埋技术) 。 2) 0.3H2O2 ,室温510分钟,灭活内源性酶。 ( 30H2O2 1份+PBS 100份混合配制新鲜) PBS洗5分钟 3次。 3) 0.5X-10
10、0,室温510分钟, PBS洗5分钟 3次。,4) 抗原修复热修复:将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液 (PH6.0)电炉或微波炉加热至沸腾后 断电,间隔510分钟后,反复12次。抗原修复液:滴加在切片上室温510分钟。 冷却后PBS洗5分钟 3次; 对于大部分指标,可以直接进入下一步;,5) 滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去 多余液体。阻断组织与抗体非特异性 结合,降低背景染色。 6) 滴加抗,室温1小时或4过夜或者 371小时后4过夜;PBS洗5分钟 3次; 7) 滴加生物素化二抗, 371小时;PBC洗5分钟 3次; 8) 滴加试剂ABC复合物,37 1小时; PBS洗5分钟
11、3次;,9)DAB显色:使用DAB显色试剂盒, 室温显色,镜下控制反应时间, 一般在510分钟之间。 10) 流水冲洗。或苏木素复染细胞核2分钟。 11)脱水或烤干、透明、封片、镜下观察。,五、对照实验,对免疫组织化学的结果判断应持科学的态度,要准确判断阳性和阴性,排除假阳性和假阴性结果,必须严格对照实验。主要针对第一抗体对照。,1、阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色,对照切片应呈阳性结果,称为阳性对照。证明全过程均符合要求,尤其当待测标本呈阴性结果时,阳性对照尤为重要。2、 阴性对照用空白、替代对照都属于阴性对照。,理、微生物学们与疾病长期斗争的经验总结及阴阳五
12、行、八纲脏腑辨证基础上，运用朴素辩证法及思辨推理方法，认识机体、自然、疾病三者关系，发展起来的一门以“功能人”包括功能脏器为概念的独特的医学哲学理论体系。在治疗上，除了药物外，还有针灸、推拿气功、耳针等特殊疗法，它是世界传统医学中最完善的一种医学理论体系。它为人类尤其为中国人民健康和民族繁衍做出了巨大贡献。 西医学是最近三四百年来建立在解剖学、生物学及现代科学技术基础上、发展起来的一门以“解剖人、肉体人”为概念的、新兴的现代医学科学理论体系。主要采用科学实验方法，从宏观到微观，直至目前的分子基因层次水平，发展极为迅速，超过其它任何一门医学科学，成为世界医学史上的主流。 可见中西医学，一个是以“
13、功能人”为概念的独特的哲学医学理论体系，一个是以“解剖人、肉体人”为概念的新兴的现代医学科学理论体系，二者都不是以完整人为研究对象的科学，从理论讲二者都不是科学的，势必影响各自发展。事实也证明这一切，中医长期停滞不前、疗效也不确实。西医尽管发展到目前的基因分子层次，但疾病发病率居高不下，对绝大部分疾病发病原因认识不清、发病机理弄不明白，治疗受到制约，在小小SARS、禽流感面前竟束手无策，在糖尿病、癌症、心脑血管疾病、尿毒症等相当多疾病面前更是不得不求助或借助中医治疗。一个是疗效不确实，一个是有些甚至相当多疾病无法治疗，这就是中西医学结合的缘由。然而，由于二者是两套理论、两股道上跑的车，风马牛不
14、相及，从理论上讲就没有结合的可能，只是形式上的融合罢了。故出现西医对治疗不了的疾病只好求助中医，而中医则往往采用西医诊断中医治疗，以及中西治疗法一块用的局面。 至于循证医学、比较医学、后现代医学、行为医学等所谓“医学”，都、解剖、病理学、药理学、统计学、流行病学，中医学及中医技能等，来治疗疾病与促进健康。虽然东西方由于思维方式的不同导致研究人体健康与外界联系及病理机制的宏观微观顺序不同，但在不远的将来中西医实践的丰富经验的积累和理论的形成必将诞生新的医学-人类医学。 不同于现代医学，不同于传统中医， 金水医学诞生了，金水医学是以驱除病理，恢复生理为主张的全新医学，走出了人类医学的误区，治疗疾病
15、的特色鲜明，不论是任何疾病都能做到从危为安，由重到轻的恢复办法。金水医学认识到人体是生命体，生命体有自己的强大的生理自我愈合功能，帮助生命体恢复自主作用才是治疗疾病的根本。针对当今现代文明病，现代疑难病，现代慢性病，亚健康，一体多病，取得了巨大的成功，治疗法则为“胃肠洁，气血流，玄府开，营卫昌”人生命体运动符合自然节律，最终达到人体生理增强，消灭疾病的目的。 编辑本段医学的分类学 内科学 外科学 泌尿科学 妇产科学 儿科学 老年医学 眼科学 耳鼻喉科学 口腔医学 传染病学 皮肤医学 神经医学 精神病学 肿瘤医学 急诊医学 麻醉学 护理学 家庭医学 性医学 临终关怀学 康复医学 保健医学 听力学
16、。现今医学分为传统医学、基于“生物-医学模式”近代发展起来的西医，20世纪西医又发展到“社会-心理-生物医学”或综合医学模式，后基因组时代系统生物学的兴起，形成了系统医学在全球的迅速发展，成为继传统医学、西医学之后中、西医学汇通的未来医学。当代中国医学类专业比较优秀的学校有北京大学、华中科技大学、郑州大学等学校。 中医即中国传统医药学，是形成于数千年前的中国，是建立在人称不上一门独立的医学科学，关于这一点在灵魂医学有关章节中将有相关点评。 总之，目前以中西医学为主的世界各种医学科学都存在不完整性的瑕疵，即都是以不完整的人为研究对象的医学科学，故不能解决目前存在于中西医学甚至人文社会科学史上一切
17、疑难模糊问题，成为阻碍医学科学前进的羁绊。的确，要解决目前存在于中西医学甚至人文社会科学上一切疑难模糊问题，显然已完全超出了中西医学所涉及的范畴，我们必须跳出中西医学的理论框架，建立起一个新的医学理论体系 - 东方医学和西方医学（即西医）的融合形成现代系统医学。该体系所涉及的一切问题不管从广度上，还是从深度上，都应该远远超过现有的中西医学理论，并将现有中西医学理论纳入自己的理论框架范围之内。为了肩负起这一历史使命，原创人生、医学理论体系灵魂医学 soul medicine应运而生，她不但从宏观上或战略上圆满解释并解决了存在于人类医学及人文社会科学史上的一切疑难模糊问题，而且还能够使人们得以启迪
18、人生，不得不重新认识人类自身、不得不重新认识人类赖以生存的这个多维世界。医学化验 医学定义（medicine），是处理人健康定义中人的生理处于良好状态相关问题的一种科学，以治疗预防生理疾病和提高人体生理机体健康为目的。狭义的医学只是疾病的治疗和机体有效功能的极限恢复，广义的医学还包括中国养生学和由此衍生的西方的营养学。现在世界上医学主要有西方微观西医学和东方宏观中医学两大系统体系。医学的科学性在与应用基础医学的理论不断完善和实践的验证，例如生化、生 医学研究 医学可分为现代医学（即通常说的西医学）和传统医学（包括中医学、藏医学、蒙医学等）多种医学体系。不同地区和民族都有相应的一些医学体系，宗旨
19、和目的不相同。印度传统医学系统也被认为很发达。 研究领域大方向包括基础医学、临床医学、检验医学、预防医学、保健医学、康复医学等。 基础医学包括：医学生物数学, 医学生物化学, 医学生物物理学 ,人体解剖学, 医学细胞生物学 ,人体生理学, 人体组织学 ,人体胚胎学, 医学遗传学, 人体免疫学, 医学寄生虫学, 医学微生物学 ,医学病毒学, 人体病理学 ,病理生理学, 药理学, 医学实验动物学, 医学心理学, 生物医学工程学 ,医学信息学, 急救学, 护病学, 新中心法则。 临床医学包括： 临床诊断学 实验诊断学.影像诊断学+ 放射诊断学+ 超声诊断学+ 核医诊断学* 临床治疗学 职能治疗学 化
20、学治疗学 生物治疗学 血液治疗学 组织器官治疗学 饮食治疗学 物理治疗学 语言治疗学 心理治疗 编辑本段医学的起源手术治疗 中、西医学的起源大致相同。主要包括：救护、求食的本能行为。如动物受伤会舐其伤口、遇热会避入水中，人与动物一样有着本能救护。人类的求食本能在寻找食物时，逐渐发现了葱、姜、蒜、粳米、薏米等虽为食物或调味品，却具有治病作用；生活经验创造了医学。先古人类通过劳动制造出利器，从而产生了砭石、骨针等医疗器具，逐渐掌握了运用工具治疗疾病的经验。与此同时，人们发现活动肢体可以舒筋活络，强身健体，“导引术”、“五禽戏”的形成，也是古代人们积累生活经验后产生的保健养生观；医、巫的合与分。由于
21、原始人受制于智力尚未开化，对自然界的变化以及宇宙间的一切反常现象，心存恐惧，难以做科学、合理的解释，因而误以为有超自然的力量主宰其中。故巫、医合流曾是中、西医学共有的一段历史。在中医学的历史进程中，“祝由”术沿袭数千年，属于元明临床“十三”科之一，但以医学为目的的解剖可追溯到公元11年(西汉王莽新朝三年)，是中国古老的实证医学萌芽。由于儒、释、道三教合流所形成的中国文化格局，“重道轻器”衍生出的务虚倾向，重体悟而疏实证，必然缺少逻辑推理，致使中国的实证医学成就在日后难以与西方医学同日而语。古埃及医师运用念咒、画符和草药治病，前二者就是巫医。西医在古希腊时期就开始医巫分家，亚里士多德曾详细描述了
22、动物的内脏和器官，古希腊医学最高成就的代表人物希波克拉底将唯物主义哲学运用于医学之中，在论圣病中说：“被人们称为神圣的疾病(指癫痫和一些精神患者)，在我看来一点也不比其他病症更神、更圣，与其他任何疾病一样起源于自然的原因。只因这些病症状奇异，而人们对它们又一无所知，充满疑惑，故而将其原因和性质归之于神灵。”亚里士多德所创立的唯物主义医学体系，加快了医学科学化的进程；轴心时代中、西医学的峰巅之作。雅斯贝而斯曾说：“如果历史有一个轴心，那么我们就必须将这轴心作为一系列对全部人类都有意义的事件，发生于公元前800至200年间的这种精神历程似乎构成了这样一个轴心。非凡的事件都集中发生在这个时期。并且是
23、独立地发生在中国、印度和西方”。这一阶段，是东、西方哲学、科学、文化发展的重要时期。此时诸子蜂起，儒家、墨家、道家、法家学派林立，形成了空前绝后的学术繁荣局面，对中华文化的发展起了奠基作用；处在古典希腊文明的开创时期，出现了德谟克利特、费底亚斯、阿基米德、苏格拉底等哲人和智者。在东、西方科学和文化昌明的大背景下，黄帝内经和希波克拉底全集代表着中、西两座医学的峰巅之作便自然而然的诞生了。内经的问世，标志着中医学已从简单的临床经验积累，升华到系统的理论总结。关于希波克拉底全集，意大利著名医史学家卡斯蒂格略尼认为：“是自然科学几乎没有萌芽的时代，在医术上具有先进性的最宝贵的代表文献。希波克拉底学派的
24、医学虽然在解剖学、生理学、病理学的知识上有缺陷，虽然只是很少而粗略地研究过动物，但是它主要是建立在临床实验和哲学推理的基础上，终能使医学提高到难以超过的高度。这是历史上最有意义的现象之一，并可能是最重要的，因为它说明通过经验，实际观察和正确的推理，可以得到极有价值的宝贵材料，他的确解决了医学历史上具有决定性倾向的开端。”比较黄帝内经和希波克拉底全集，二者的理论建构有诸多相似之处：废巫存医、整体观念、调节平衡、哲学思辩、临床实践。其中黄帝内经强调以五脏为中心的整体观，从外测内，可以不依赖解剖形态学而照样诊治疾病。其理论体系是自洽的，难以突破；希波克拉底全集虽然没有系统的解剖学和生理学等基础知识，但却强调具体的解剖结构，为医学的实证开了先河。这些差异为中、西医学的日后分向而行埋下了伏笔。,医学健康系列精品课件,本文档下载后可以修改编辑，欢迎下载收藏。,
