1、Western blot 实验技术 （免疫印迹实验）,【基本原理】,WB的过程包括蛋白质经凝胶电泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白质的抗体作为探针与之结合，经洗涤后，再将滤膜与二级试剂-放射性标记或HRP或AP偶联抗体结合，进一步洗涤后，通过放射自显影或酶反应来确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置和丰度。,Western Blot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交
2、底物显色,【器材】,转移电泳仪 ，硝酸纤维素膜，滤纸，剪刀，手套,凝胶浓度与蛋白分离范围,制胶,12%分离胶(15ml)双蒸水 4.8ml30% Arc/Bis 6ml分离胶缓冲液 (pH8.8) 4ml10% SDS 150ul10%APS 75ulTEMED 8ul灌胶，待凝，约1小时,4%浓缩胶（7.5ml）双蒸水 4.55ml30% Arc/Bis 1ml分离胶缓冲液 (pH6.8) 1.9ml10% SDS 75ul10%AP 75ulTEMED 7.5ul灌胶，插梳子，待凝，约0.5小时,准备样本加2Loading Buffer,混匀，煮沸35分钟，10000g离心10分钟取上清适
3、量上样 电泳：5mA/胶大约需时2小时,二、转移印迹 1转移前准备：将滤纸，硝酸纤维素膜（NC）剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30min。 2凝胶平衡：将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移buffer中平衡30-60min。 3按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。 4开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒流380mA，冰浴转移30min。,取出一块胶做考马斯亮兰染色另一块胶转膜 转膜：负极到正极，依次放海绵，滤纸，凝胶，硝酸纤维膜， 滤纸，海绵380mA 30分钟,三、免疫染色 1转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4过夜。 2TBS洗膜1-2次，10mi
4、n/次。 3. 加一抗孵育，37 或室温孵育1h。 4. TBS洗3次，10min/次。 5加HRP标记的抗体，室温1h 。 6TBS洗3次，10min/次。 7NC膜再转入DAB显色液中，避光反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应,转膜,半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转1030min。湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。,转膜后检测,丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过
5、程。,封闭,脱脂奶粉（5） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,一抗、二抗孵育,把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液与膜温育。37 1h或4过夜。 倒掉一抗溶液，洗膜3次， 10min/次。 加入二抗，摇床缓慢摇动， 37 1h或4过夜。 倒掉二抗溶液，洗膜3次， 10min/次。 NC膜再转入DAB显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法,1 2 3 4 M Mr 1 2 3 4,Fig 1.SDS-PAGE and Western
6、blot analysis for the CT-MOMP multi-epitopes protein,朱珊丽老师的结果,Western Blot常见问题分析,SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？,聚丙烯酰胺：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择TrisHCl系统； TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固； 十二烷基硫酸钠（SDS）：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。,SDS-PAGE电泳,胶不平？凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其
7、充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,背景太高,
