1、第五章 微生物遗传与基因组,一、遗传物质DNA（RNA）遗传的物质基础是蛋白质还是核酸，曾是生物学中激烈争论的重大问题之一。1944年Avery等人以微生物为研究对象进行的实验，无可辨驳地证 实遗传的物质基础不是蛋白质而是核酸，并且随着对DNA特性(结构的多样性，自体复制特性等)的了解，“核酸是遗传物质的基础”这一生物学中的重大理论才真正得以突破。,第一节 微生物遗传变异的分子基础,生物学三大著名的实验,（一）细菌转化实验-Griffith的转化实验 Streptococcus pneumoniae的光滑型(O型,或S型,或 S型菌株 )，光滑型菌株是有毒的，它可导致人体患肺炎、小鼠患败血症；
2、另一些菌株则不产生荚膜，菌落是粗糙的，称为粗糙型（R型, R型, S型 ），粗糙型细菌菌株是无毒的。,(1)Griffith 转化试验示意,混合培养,RII型活菌,SIII型活菌,SIII型热死菌,RII型活菌,SIII型活菌,健康,健康,健康,健康,健康,健康,健康,病死,病死,病死,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。,热死SIII菌不生长 活 RII 菌长出RII菌 热死SIII菌长出大量RII菌和10-6SIII菌,
3、活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培养,加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的RNA和RNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：,只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。,（二）噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M.
4、 Chase， 1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含 15%放射性,沉淀中含 85%放射性,沉淀中含 25%放射性,以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含 75%放射性,（三）植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分
5、离出正常病毒粒子。,选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：,（1）RNA（TMV） 蛋白质（HRV） （2）RNA（HRV） 蛋白质（TMV） 用两种杂合病毒感染寄主： （1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子 （2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。 上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。,MTV HRV,HRV MTV,朊病毒的发现和思考?,无论是DNA还是RNA作为遗传物质的基础已是无可辨驳的事实。 但朊病毒(prion)的发现对“ 蛋白质不是遗传物质”的定论也带
6、来一些疑云。 prion是具有传染性的蛋 白质致病因子，迄今未发现该蛋白内有核酸。 但已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸 (DNA或RNA)组成的遗传物质，才能感染宿主并在宿主体内自然繁殖。,那么这是生命界的又一特例呢? 还是因为目前人们的认识和技术所限而尚未揭示的生命之谜呢? (如有人坚持认为prion中可能含有极微量的核酸)还有待生命科学家去认识和探索。 但prion的致病性是由于prion改变折叠状态所致，这一广为证实的事实，已是当今分子生物学研究的热点之一由蛋白质的折叠与生物功能之间的关系的研究延伸至与疾病的致病因子之间的关系的研究，为治疗和根除prion引起的疾病(有人称为构象病
7、)开辟新的途径。,“第二遗传密码”“折叠密码”?,1958年，DNA双螺旋结构模型的奠基人之一，英国科学家Crick以DNARNA蛋白质(或多肽链)的单向传递形式，首次提出遗传信息传递的中心法则。三联密码将使RNA(mRNA)中的 核苷酸序列转变成新生肽链中的氨基酸序列。现已知道，新生肽链必须经过一系列极其复杂 的加工和成熟过程，形成特定空间结构后才能成为有活性的蛋白质，这个过程包括氨基 酸残基的化学修饰和正确、适时的折叠。60年代，Anfinsen曾提出蛋白质的氨基酸 序列已经包含了它的三维结构的全部信息，或一级结构决定高级结构，但是一级结构到底如 何决定高级结构的呢?如果说三联密码，即三个
8、碱基决定一个氨基酸是“遗传密码”，那么多肽链中氨基酸序列如何决定蛋白质的空间结构是否也存在另一套密码“折叠密码”呢 ?“折叠密码”的翻译过程又是怎样的呢?中心法则是否应表述为：DNARNA多肽链蛋白质呢?这是现代分子生物学研究中尚未解决的核心问题之一。,第二节 微生物基因组及其结构特征,基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传单位，其物质基础就是一段特定核苷酸组成的核酸片段。 基因组(genome)是指存在于细胞或病毒中的所有基因。细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体(hoploid)；真核微生物通常是有二套基因又称二倍体(diploid)。基因组通常是指全部一套基因。 目前基因组的含义实
9、际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列组成的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的DNA序列。,微生物与几种代表生物的基因组,一、大肠杆菌的基因组,基因组全序列测定于1997年由Wisconsin大学的Blattner等人完成. 大肠杆菌基因组为双链环状的DNA分子，在细 胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)， 其上结合有类组蛋白蛋白质和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的(scaffold)致密结 构(大肠杆菌DNA分子长度是其菌体长度的1000倍，所以必须以一定的形式压缩进细胞中) 。 大肠杆菌及其它原核细胞
10、就是以这种拟核形式在细胞中执行着诸如复制、重组、转录、 翻译以及复杂的调节过程。,1.遗传信息的连续性大肠杆菌和其它原核生物中基因数基本接近由它 的基因组大小所估计的基因数(通常以1000bp1500bp为一个基因计)，说明这些微生物基因 组DNA 绝大部分用来编码蛋白质、RNA；用作为复制起点、启动子、终止子和一些由调节蛋白识别 和结合的位点等信号序列。除在个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tR NA中发现有内含子或间插序列外，其它绝大部分原核生物不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。,2.功能相关的结构基因组成操纵子结构,大肠杆菌总共有2584个操纵子，基因组测序
11、推测出2192个操纵子。其中73%只含一个基因，16.6%含有2个基因，4.6%含有3个基因，6%含有4个或4个以上的基因。大肠杆菌有如此多的操纵子结构，可能与原核基因表达多采用转录调控有关，因为组成操纵子有其方便的一面。,此外有些功能相关的RNA基因也串联在一起，如构成核糖核蛋白体的三种RNA基因转录在同一个转录产物中，它们依次是16SrRNA23SrRNA5SrRNA。这三种RNA除了组建核糖体外，别无他用，而在核糖体中的比例又是111，倘若它们不在同一个转录产物中，则或者造成 这三种RNA比例失调，影响细胞功能；或者造成浪费；或者需要一个极其复杂、耗费巨大的调节机构来保持正常的111。,
12、3.结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝,在大多数情况下结构基因在基因组中是单拷贝的，但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的，大肠杆菌有7个rRNA操纵子，其特征都与基因组的复制方向有关，即按复制方向表达。 7个rrn操纵子中就有6个分布在大肠杆菌DNA的双向复制起点oric附近，而不是在复制终点附近，可以设想，在一个细胞周期中，复制起点处的基因的表达量几乎相当于处于复制终点的同样基因 的两倍，有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时，细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。 大肠杆菌及其它原核生物(如枯草杆菌的rrn有10个拷贝)rrn多拷贝及结构基因的单拷贝，也反映了它们基因组经济
13、而有效的结构。,4.基因组的重复序列少而短,原核生物基因组存在一定数量的重复序列，但比真核生物少得多，而且重复的序列比较短，一般为440个碱基，重复的程度有的是十多次，有的可达上千次。 例外的情况: *典型的原核生物染色体是环状DNA分子，但发现布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的染色体是线状的。*流感嗜血菌基因组上有1465个“摄取位点”的重复，其重复序列为5-AAGTGCGGTCA-3。,二、啤酒酵母的基因组,啤酒酵母是单细胞真核生物，1996年，由欧洲、美国、加拿大和日本共96个实验室的633位科学家的艰苦努力完成了全基因组的测序工作，这是第一个完成测序的真核生物基
14、因组。,啤酒酵母的染色体,啤酒酵母的基因组特点,该基因大小为13.5106bp，分布在16个不连续的染色体中。 象所有其它的真核细胞 一样，酵母菌的DNA也是与四种主要的组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)结合构成染色质(chromatin)的14bp核小体核心DNA 染色体DNA上有着丝粒(centromere)和端粒(telomere)，没有明显的操纵子结构，有间隔区或内含子序列。 酵母菌基因组最显著的特点是高度重复， 从上表可看出tRNA基因在每个染色体上至少是4个，多则30多个，总共约有250个拷贝(大肠 杆菌约60个拷贝)。 此外,rRNA基因只位于号染色体的近端粒处，每个长9137
15、bp，有100200个拷贝。,发现问题:,酵母基因组全序列测定完成后，在其基因组上还发现了许多较高同源性的DNA重复序 列，并称之为遗传丰余(genetic redundancy)。 酵母基因组的高度重复或遗传丰余是一种浪费和多余呢?还是一种进化的策略呢?,所有现存的生物在自然的不断选择下 ，总是以合适的结构特征来完成其生命过程。 这么多的丰余基因是为了保证，如果有少数基因突变而失去功能的话，可不影响生命的生存；也许是为了适应复杂多变的环境，多余的基因可使生物体能够在不同的环境中分别使用多个功能相同或者相似的基因产物，做到有备无患。 因此从这个意义上讲酵母确实比细菌和病毒“进步”且“富有”，而
16、细菌和病毒( 许多病毒基因组上的基因是重叠的)似乎更“聪明”，知道如何尽量经济和有效地利用其有限的遗传资源。,三、原核生物的质粒,定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋DNA分子，能独立于细胞核进行自主复制。 大小：约为2100106Dalton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。 性质： 可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在； 质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数
17、几个（15）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10200个或更多。,可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。 对于细菌的生存并不是必要的 功能多样化,三、原核生物的质粒,质粒和转座因子,质粒(plasmid)和转座因子(transposable element)都是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子。前者是一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于
18、各种微生物细胞中；后者是位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。,微生物向邻居“借”或“盗用”基因,微生物通过接合、转导和转化进行的水平方向的基因转移是早已知道的事实。但近年来的研究表明，微生物似乎还善长向邻居“借”或“盗用”(appropriate)基因。这些邻居包括它们的“同类”微生物，也包括它们的“异类”高等动植物。 基因组序列分析表明，生活在意大利海底火山口附近的激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)含有来自近邻但亲缘关系较远的Thermococcus litotralis的转运麦芽糖的基因，序列分析表明二者仅有138bp的差异，而
19、生活在太平洋的同种激烈热球菌却没有这种基因。激烈热球菌的转运麦芽糖基因看来是向T.litoaralis“借来”的，是否会“还”回去，目前难以得知。此外，微生物还有向高等动、植物“盗用”(appropriate)基因的本领。例如，耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)含有几个只有在植物中才有的基因；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的基因组上至少含有8个来自人的基因，而且这些基因编码的蛋白质能帮助细菌逃避宿主的防御系统，显然，这是结核分枝杆菌通过某种方式从宿主那儿“盗用”了这些基因为自己的生存服务。有关“借”或“盗用”的机制目前还不很清
20、楚，但转座因子的普遍存在及其转座功能可能起了很大的作用。 * Penis i E. 1999, Science, 5418:13051306,功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。 重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。 存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等 制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。 鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法,三、原核生物的质粒,质粒的分子结构,质粒通常以共价闭
21、合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中，但从细胞中分离的质粒大多是三种构型，即CCC型、OC型(open circular form)和L型(linear form)。 近年来在疏螺旋体、链霉菌和酵母菌中也发现了线型双链DNA质粒和RNA质粒。 质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb。,几种代表性质粒：,1. F因子（fertility factor）：又称致育因子或性因子，62106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。
22、存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.,最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现还存在于Salmonell
23、a、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。 R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（r-determinant），RTF为分子量约为11106Dalton，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。 R-因子在细胞内的copy数可从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达20003000个/细胞。,2. R因子（resistence factor
24、）,产大肠杆菌素因子。 大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约41048104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。 Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。 ColE1分子量约为5106Dalton，无接合作用，是多copy的； ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。 ColIb分子量约为80106Dalton，它与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有12个copy。 凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋
25、白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,3. Col因子（colicinogenic factor）,降解性质粒只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,4. 降解性质粒,即诱癌质粒。 存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。 当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植
26、物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。,5. Ti质粒（tumor inducing plasmid）,是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200300106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,
27、6. 巨大质粒（mega质粒）,7. cos质粒,插入片段37-45kb,8. BAC,细菌人工染色体插入片段50-100kb,四、真核生物载体,YAC PAC FAC等,五、质粒的不亲和性,细菌通常含有一种或多种稳定遗传的质粒，这些质粒可认为是彼此亲和的(compatible)。 但是如果将一种类型的质粒通过接合或其它方式(如转化)导入某一合适的但已含一种质粒的宿主细胞，只经少数几代后，大多数子细胞只含有其中一种质粒，那么这二种质粒便是不亲和的(incompatible)，它们不能共存于同一细胞中。质粒的这种特性称为不亲和性(incompatibility)。,根据某些质粒在同一细菌中能否并
28、存的情况，可将质粒分成许多不亲和群(incompatibility group)，能在同一细菌中并存的质粒属于不同的不亲和群，而在同一细菌中不 能并存的质粒属于同一不亲和群。,当二种同一不亲和群的质粒共处同一细胞时，其中一种由于不能复制因而在细胞的不断分裂过程中被稀释掉(diluted out)，或被消除(curing)。所谓消除是指细胞中由于质粒的复制受到抑制而染色体的复制并未明显受到影响，细胞可继续分裂的情况下发生的质粒丢失。质粒消除可自发产生，也可通过人工处理提高消除率，例如，用一定浓度的吖啶橙染料(acrid ine dyes)或其它能干扰质粒复制而对染色体复制影响较小的理化因子处理细
29、胞，可消除质粒。,第三节 细菌基因转移、重组与杂交育种,遗传性是指生物的亲代将全部遗传信息传递给其子代的特性。 遗传：生物体的亲代将自己的性状传递给子代的过程 变异（突变）：在遗传的过程中，亲代的某些性状或基因发生变化的过程,一、微生物的变异现象,遗传密码：指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序,密码子（coden）：由3个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位 不对称转录：只有DNA双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。 起始密码子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸 终止密码子：UAA、UGA、UAG,二、基因突变,基因突变又称点突变：这类突变只涉及到DNA链上的一对或少数几对
30、碱基的类型、数目或分子结构的变化。,依表型的改变分为： 形态突变型 营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。 发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型 抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性 条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型 抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变 产量突变型,（一）基因突变的类型,碱基变化与遗传信息的改变,不同的碱基变化对遗传信息的改变是不同的，可分为四种类型 ： (1)同义突变(same-sense mutation)这是指某个碱基的
31、变化没有改变产物氨基酸序列的密码子变化，显然，这是与密码子的简并性相关的。 (2)错义突变(mis-sense mutation)是指碱基序列的改变引起了产物氨基酸的改变。有些错义突变严重影响到蛋白质活性甚至使之完全无活性，从而影响了表型。如果该基因是必需基因，则该突变为致死突变(lethal mutation)。 (3)无义突变(nonsense mutation) 是指某个碱基的改变，使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子(UAA，UAG，UGA)。蛋白质的合成提前终止，产生截短的蛋白质。 (4)移码突变(frameshift mutation)由于DNA序列中发生1-2个核苷
32、酸的缺失式插入，使翻译的阅读框发生改变，从而导致从改变位置以后的氨基序列的完全变化。,（二）基因突变的分子基础,1.自发突变 不经诱变剂处理而自然发生的突变称自发突变。具有如下特性： 非对应性：突变的发生与环境因子无对应性。 稀有性：自发突变的频率(突变率)很低，一般在10-610-9。 规律性：特定微生物的某一特定性状的突变率具有一定的规律性，例如大肠杆菌总是以 310-8的频率产生抗噬菌体T1的突变，以110-9的频率产生抗链霉素突变；而金黄色葡萄球菌总是以110-7产生抗青霉素突变等。 独立性：引起各种性状改变的基因突变彼此是独立的，即某种细菌均可以一定的突变率产生不同的突变，一般互不干
33、扰。 遗传和回复性：突变是遗传物质结构的改变，因此是可以稳定遗传的。但同样的原因也可以导致突变的回复，使表型回复到野生型状态。 可诱变性：通过理化因子等诱变剂的诱变作用可提高自发突变的频率，但不改变突变的本质。,定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是108 。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数,突变率,自发突变的分子基础,引起自发突变的原因很多
34、，包括DNA复制过程中，由DNA聚合酶产生的错误，DNA的物理损伤，重组和转座等。但是这些错误和损伤将会被细胞内大量的修复系统修复，使突变率降到最低限度。,自然突变的一个最主要的原因是碱基能以称之为互变异构体(taumer)的不同形式存在，互变异构体能够形成不同的碱基配对，因此在DNA复制时，当腺嘌呤以正常的氨基形式出现时，便与胸腺嘌呤进行正确配对(A-T)；如果以亚氨基(imino)形式(互变异构)出现时，则与胞嘧啶配对，这意味着C代替T插入到DNA分子中，如果在下一轮复制之前未被修复，那么DNA分子中的A-T碱基对就变成了G-C。,2.诱变突变 许多化学、物理和生物因子能够提高其突变频率，
35、将这些能使突变率提高到自发突变水平以上的物理、化学和生物因子称为诱变剂(mutagen)。 所谓诱发突变并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率。,常用的诱变剂有：,(1)碱基类似物(Base analog) 例如：5-溴尿嘧啶(胸腺嘧啶结构类似物)和2-氨基嘌呤(腺嘌呤结构类似物)，在DNA复制过程中能够整合进DNA分子，但由于它们比正常碱基产生异构体的频率高，因此出现碱基错配的机率也高，从而提高突变频率。 (2)插入染料(intercalating dye) 这是一类扁平的具有三个苯环结构的化合物，在分子形态上类似于碱基对的扁平分子。所以它们是通过插入DNA分子的碱基对之间
36、，使其分开，从而导致DNA在复制过程中的滑动，这种滑动增加了一小段DNA插入和缺失的机率，导致突变率的增加，常引起移码突变。溴化乙锭和吖啶橙是这类诱变剂的代表。,(3)直接与DNA碱基起化学反应的诱变剂 最常见的有亚硝酸、羟胺和烷化剂。亚硝酸能引起含NH2基的碱基(A.G.C)产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，从而改变配对性质造成碱基置换突变。 羟胺(NH2OH)几乎只和胞嘧啶发生反应，因此只引起GCAT的转换。甲磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)和亚硝基胍(nitrosoguanidine, NTG)都属于烷基化试剂，其烷基化位点主要在鸟嘌呤的N-7位和腺嘌呤
37、N-3位上。但这两个碱基的其它位置以及其它碱基的许多位置也能被烷化，烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误。亚硝基胍是一种诱变作用特别强的诱变剂，因而有超诱变剂之称，它可以使一个群体中任何一个基因的突变率高达1%，而且能引起多位点突点，主要集中在复制叉附近，随复制叉的移动其作用位置也移动。此外，硫酸二乙酯、乙基磺酸乙酯以及二乙基亚硝酸胺等也都是常用的诱变烷化剂。,(4)辐射和热 紫外线(ultraviolet,简称UV)是实验室中常用的非电离辐射诱变因子，其作用机制也了解得比较清楚，由UV引起的主要损伤是相邻碱基形成二聚体(dimer)，阻碍碱基的正常配对而导致碱基置换突变。另
38、方面当细胞用一种称之为SOS的倾向错误(errorprone )的修复系统来修复损伤时，还会导致高频率的突变。 x-射线、r-射线，快中子等属于电离辐射，作用机理尚不十分清楚，与UV不同的是电离辐 射可通过玻璃和其它物质，穿透力强，能达到生殖细胞，因此常用于动物和植物的诱变育种。 短时间的热处理也可诱发突变，据认为热的作用是使胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶，从而导致GCAT的转换，另外，热也可以引起鸟嘌呤脱氧核糖键的移动，从而在DNA复制过程中出现包括二个鸟嘌呤的碱基配对，在再一次复制中这一对碱基错配就会造成GCCG颠换。,(5)生物诱变因子 转座因子也是实验室中常用的一种诱变因子，它们在基因组的任
39、何部位插入，一旦插入某基因的编码序列，就引起该基因的失活而导致中断突变，而且由于转座因 子Tn、Mu带有可选择标记(抗生素抗性等)，因此可容易地分离到所需的突变基因。,诱变剂与致癌物质Ames试验,现已发现许多化学诱变剂能够引起动物和人的癌症，因此利用细菌突变来检测环境中存在的致癌物质是一种简便、快速、灵敏的方法。 该方法是由美国加利福尼亚大学的Ames教授首先发明，因此又称Ames试验，该试验是利用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)的组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变性能来进行的。his-菌株在不含组氨酸的培养基中不能生长，或只有极少数的自发回复突变子生长，
40、如果回复突变率因某种化学诱变剂(或待测 物)的作用而增加，那么这种化学药物可判断为具有致癌性。 所谓回复突变(reverse mutation或back mutation)是指突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。,（三）DNA损伤的修复,细胞在其DNA复制过程中会出现差错，会出现自发和诱发的前突变或损伤，其中许多是致死性的，细菌为了生存必须对其进行校正和修复。 已知DNA聚合酶除了5-3的DNA复制功能外，还有3-5核酸外切酶活性的纠错功能，随时进行错配碱基的校正。 除此之外，细胞中还有比较复杂的修复系统，研究得比较详细的是UV引起的嘧啶二聚体的修复
41、，主要有下列几种类型：,光复活作用（photoreactivation）,定义：经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。 这一现象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomyces griseus（灰色链霉菌）中发现的。后来，在许多微生物中都得到了证实。最明显的是在E.coli的实验中： 对照：8106个/ml E.coli U.V. 100个/ml E.coli 试验：8106个/ml E.coli U.V. 2106个/ml E.coli可见光，30分 经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种光激活酶（p
42、hotoreactivating enzyme）即光裂合酶（photolyase）结合，当形成的复合物暴露在可见光（300500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。与此同时，光激活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能。每一E.coli细胞中约含有25个光激活酶分子。 由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液。,图:光复活作用,暗修复作用（dark repair）,又称切除修复（excision repair）。是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、X射线和射线等）损伤后的DNA的机制。这
43、种修复作用与光无关。有四种酶参与内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5一侧切开一个3-OH和5-P的单链缺口；外切核酸酶从5-P至3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；DNA聚合酶以DNA的另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起逐个延长，重新合成一段缺失的DNA链；通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3-OH末端与原链的5-P末端相连接，从而完成了修复作用。,暗修复作用（dark repair）,1、由核酸内切酶切开二聚体的5末端，形成3-OH和5-P的单链缺口 2、核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。 3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合
44、成缺失片段。 4、连接酶将新合成的3-OH与原有的5-P相连接。,紫外诱变方法:,设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等， 紫外灯：波长为253、7nm, 功率是15W 处理时的照射距离：20cm 30cm 样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm 照射时，要用磁力搅拌器搅拌。 处理剂量：常用照射时间或死亡率作为相对剂量。,由于微生物接受的照射剂量与灯的功率、照射距离、照射时间、菌液浓度、菌液厚度、细胞本身特性等因素有关，所以单纯用时间表示照射剂量并不完全可靠。一定的死亡率必定对应一定的照射剂量，所以，在实际应用中，用死亡率表示照射剂量更可靠。通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线，然后选择合适
45、的剂量。生产上经常采用的剂量：死亡率为70%80%左右。,诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,（四）诱变育种,诱变育种的步骤：,原始菌种,纯化,斜面/肉汤培养,单孢子/单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异，挑单菌落,良种保藏,原菌种特性鉴定,诱变育种的基本过程：,选择选择合适的出发菌株 制备待处
46、理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验,1.出发菌株的选择： 出发菌株用来育种处理的起始菌株 出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,2.制备细胞悬液 要求： 菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypic lag）; 方法： 玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。 制备： 物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl) 化学诱变剂缓冲液 浓度： 细菌、放线菌 108
47、个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,表型迟延现象:指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。 产生原因： 分离性迟延现象 生理性迟延现象,3.诱变处理： 诱变剂的作用：提高突变的频率扩大产量变异的幅度使产量变异朝着正突变或负突变移动 剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。 最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在7080%）,选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最
48、方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。 简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反映的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。,常用诱变剂的使用方法,4. 菌种筛选,4.1 筛选方案： 实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。 复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,
