1、第五次实验 结核分枝杆菌与其他原 核细胞型微生物微生物学教研室,1、检查牙垢中螺旋体（1份/人） 2、结核痰标本抗酸染色（1份/人） 3、真菌检查法（1份/人） 4、观察结核杆菌培养物（示教） 5、观察梅毒螺旋体形态（示教） 6、观察支原体集落（示教） 7、HIV（录象）,实验内容,教学目的认识痰标本的抗酸染色方法及结核分枝杆菌的菌落特点认识螺旋体及支原体形态学观察方法认识真菌检查法,教学要求掌握结核分枝杆菌的染色方法及结果判断掌握真菌检查法熟悉结核分枝杆菌的菌落特点与螺旋体及支原体形态学观察方法,结核痰标本抗酸染色,结核标本的检查有直接涂片，培养及动物接种等几种方法，直接涂片抗酸染色镜检找到
2、抗酸杆菌，可作初步诊断。如标本量大，污染杂质多，含结核杆菌数较少时，直接涂片染色往往不易检出，因一般每毫升痰液含10万个结核杆菌以上才能检出，故如先浓缩集菌处理，再进行涂片检查，可以提高阳性率。在镜检发现抗酸性不强或菌型不典型时，应考虑非典型分枝杆菌，需作进一步分离培养鉴定。动物接种可供标本分离及测定结核杆菌的毒力。,结核痰标本抗酸染色,原理抗酸性染色也是一种重要的鉴别染色。由于抗酸性细菌含有分枝菌酸。在完整的细胞壁中它能与石炭酸和复红所形成的复合物牢固地结合，并能抵抗酸性酒精的脱色，故被染成红色，而非抗酸性细菌因不含有分枝菌酸，故易脱色，并被复染剂染成兰色。,材料,标本：肺结核病人的痰,染液
3、：石炭酸复红 碱性美兰 3盐酸酒精,其他: 接种环、酒精灯、75 酒精,方法,挑取痰液涂片（厚涂片）干燥 固定石炭酸复红15分钟（初染） 水洗 3盐酸酒精（脱色）水洗 碱性美兰1分钟（复染）水洗 干燥镜检,注意：厚涂片,结核病人痰标本涂片,重复三次!,箭头所示为抗酸菌,形态 染色性 排列,形态染色菌体细长微弯，有分枝，排列不规则，多单个散在，易发生L型，抗酸染色阳性,检查牙垢中螺旋体,螺旋体是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状，多数比细菌大，介于细菌与原虫之间，无鞭毛，但有轴丝（壁与膜之间），运动活泼的G-原核细胞型微生物，广泛分布于自然界与动物体，种类多，多为非致病性，仅少数对人致病，对人致病的有
4、钩端螺旋体、回归热螺旋体和梅毒螺旋体等。 正常人口腔牙龈部寄居有奋森氏螺旋体，并与梭形杆菌共存，当机体抵抗力下降时（如病后），这两种菌大量繁殖，梭形杆菌协同奋森氏螺旋体可引起奋森咽峡炎、奋森氏口炎、牙龈炎和口腔坏疽等。,材料,牙签 、 生理盐水、玻片染液结晶紫、碘液、 95%酒精、稀释石碳酸复红,方法,1玻片一张，放生理盐水1-2环，用牙签取牙垢少许与生理盐水混合制成涂片2待涂片干后火焰固定, 革兰氏染色,镜检,牙垢螺旋体检查涂片制备,标本涂片-干燥-固定-结晶紫初染1分钟-水洗-碘液媒染1分钟-水洗-95%酒精脱色-水洗-稀释石碳酸复红染液复染30秒钟-水洗-自干或烘干、印干-镜检（油镜）,
5、真菌检查法,真菌（fungus）是一大类具有细胞壁和典型细胞核不含叶绿素，不分根、茎、叶的真核细胞型微生物。真菌的形态有单细胞和多细胞两大类，单细胞真菌呈圆形或卵圆形常见于酵母菌，类酵母菌以出芽方式繁殖。多细胞真菌大多长出菌丝与孢子，各种多细胞真菌的菌丝与孢子形态不同，菌落特征也不同，是鉴别真菌的重要标志。,真菌基本形态 单细胞真菌：白假丝酵母，卵圆形，革兰染色阳性，着色不一，可见假菌丝。,多细胞真菌形态,菌落特征:酵母型菌落类酵母型菌落丝状菌落,单细胞,多细胞,酵母型菌落,类酵母型菌落,酵母型菌落,类酵母型菌落,真菌的菌落 白假丝酵母：菌落圆形，较大，白色菌落底层有假菌丝多细胞真菌：观察气生
6、菌丝，营养菌丝，表面隆起，浅沟及菌落基底颜色。,白假丝酵母 (血平板),黄曲霉,1、营养要求不高，常用沙保弱培养基培养。 2、生长缓慢，培养14周才出现典型菌落。 3、培养温度为22-28，但某些深部真菌最适生长温度为37。 4、最适酸碱度为PH4.06.0。 5、湿度要求较高。,真菌培养特性,原理,直接涂片检查用显微镜直接检查标本中有无菌丝及孢子的存在，对皮肤丝状菌的感染可作初步诊断，本法简单迅速易行。,材料,标本:脚皮等试剂:10KOH其他:玻片、镊子、酒精灯等,方法 KOH透明法,（1）取脚皮少许于玻片上，加二滴10%KoH溶液，覆盖一盖玻片，置火焰上微微加热，以加速角质溶解，使标本透明
7、，然后微微加压，使成薄片，并需驱去气泡，用吸水纸吸去周围溢液，（如为毛发标本，切忌加热加压过甚，以保持毛发原形为宜，便于观察真菌与毛发的关系）显微镜检查。 （2）将已制备的标本片，先用低倍镜检查，然后再用高倍镜证实,注意：盖玻片倾斜45度慢慢盖上，不能产生气泡！,标本片制备,真菌检查镜下观,报告：“找到菌丝或孢子”“找到发外孢子”“找到发内菌丝”,各种操作步骤,抗酸染色:挑取痰液涂片（厚涂片） 干燥 固定石炭酸复红20分钟（初染） 水洗 3盐酸酒精(脱色) （粉红到无色） 水洗 碱性美兰1分钟（复染） 水洗 干燥 镜检,牙垢螺旋体检查:标本涂片-干燥-固定-结晶紫初染1分钟-水洗-碘液媒染1分
8、钟-水洗-95%酒精脱色(淡紫色到无色)-水洗-稀释石碳酸复红染液复染30秒钟-水洗-自干或烘干、印干-镜检（油镜）,真菌检查法:（1）取脚皮少许于玻片上，加二滴10%KoH溶液，覆盖一盖玻片，置火焰上微微加热，以加速角质溶解，使标本透明，然后微微加压，使成薄片，并需驱去气泡，用吸水纸吸去周围溢液，（如为毛发标本，切忌加热加压过甚，以保持毛发原形为宜，便于观察真菌与毛发的关系）显微镜检查。 （2）将已制备的标本片，先用低倍镜检查，然后再用高倍镜证实,观察结核杆菌培养物,培养特性： 专性需氧，最适37 ，营养要求高，生长缓慢，18h分裂一代。罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基含蛋黄
9、、甘油、马铃薯、无机盐、孔雀绿，24周可见菌落生长，菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色，不透明。在液体培养基(甘油肉汤)，生长于表面，有皱褶。,观察梅毒螺旋体形态,梅毒螺旋体：Fontana镀银染色，菌体非常细小，弯曲，螺旋状，呈棕褐色，有紧密螺旋。,支原体,支原体是一类没有细胞壁，呈多形性，能在无生命的培养基中生长繁殖的最小微生物。大小介于细菌和病毒之间。普通染色不易着色，用Giemsa染色着色较浅。革兰染色为阴性。营养要求较高，需要在含1020%马血清和酵母浸液的培养基上生长。最适的pH7.8 8.0.生长缓慢,在固体培养基上培养2 3天后才出现菌落。典型的菌落呈“荷包蛋”状，中心厚边缘薄的菌落形态。菌落表面呈颗粒状,观察支原体集落,第五次实验课小结,1、抗酸染色的原理、步骤、结果、意义2、结核杆菌章节的重点内容（特性、PPD试验、相关名词等）3、螺旋体的分类及各自的特点，尤梅毒螺旋体,第五次实验报告,检查牙垢中螺旋体结核痰标本抗酸染色真菌检查法,第六次实验内容,1、病毒组织培养法（录象） 2、血凝试验（1份/组） 3、鸡胚尿囊腔接种（1份/组） 4、观察病毒形态（电镜照片）及包涵体（示教） 5、讲解病毒分离培养及实验总结,
