1、发酵过程控制是发酵的重要部分 控制难点：过程的不确定性和参数的非线性 同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的,发酵过程工艺控制,一 发酵过程工艺控制的目的,有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来 目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率,第一节 发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的基本
2、方法，在此基础上再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及进行优化放大。,二 发酵过程研究的方法和层次,1、研究方法,单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验 优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。 缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长 各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性,例：最佳pH的确定,配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况,pH对产海藻酸裂解酶的影响,数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。 优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，
3、经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。,例 利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量,背景： （1）酵母在比常规发酵温度髙10200C的温度下经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。 （2）Lewis发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的耐受力 （3）Toshiro发现热冲击可使胞内3磷酸甘油脱氢酶的活力提高1525，并导致甘油产量提高,实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，因此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量,正交条件A 冲击温度（0C） 40
4、，45，50B 开始时机（h） 8，16，30C 冲击时间（分） 15，30，60,A 温度；B 开始时机；C 冲击时间,结果发酵16小时，45 冲击30分钟最佳，发酵96小时后甘油浓度提高32.6,2、研究的层次初级层次的研究： 一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。 摇瓶研究的优点是处理量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。,摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础,代谢及工程参数层次研究：一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应
5、器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到的代谢情况比较可信。,小型发酵罐：反应器水平,参数连续,鸟苷发酵过程曲线,生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产业化的实现。 一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同所致。,第二节 发酵过程的中间分析,发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化
6、。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。 这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等,一 发酵过程的主要控制参数,参数按性质分可分三类： 一物理参数1. 温度：指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。2. 压力：发酵罐维持的压力。3. 搅拌转速：搅拌器在发酵罐中转动速度 4. 搅拌功率：搅拌器搅拌时所消耗的功率与氧体积传递系数Kla有关5. 空气流量：与氧的传递，其他控制参数有关6. 粘度：粘度可作为细胞生长或细胞形态的一项指标，也能反映发酵罐中
7、菌丝分裂过程的情况，可表示菌体的相对浓度，并可改变氧传递阻力7. 浊度：可表示单细胞生长状况的参数,二、 化学参数1. PH：是发酵过程中各种产酸，产碱生化反应的综合结果，与菌体生长和产物合成有重要的关系2. 基质浓度：发酵液中糖，氮，磷等重要营养物质的浓度，它们的变化对生产菌的生长和产物的合成有重要影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。必须定时（或实时）测定糖（还原糖，总糖），氮（氨基氮或铵氮）等基质浓度。3. 溶解氧浓度：氧是微生物体内一系列细胞色素氧化酶催化产能反应的最终电子受体，也是合成某些产物的基质。所以利用DO浓度的变化，可以了解微生物对氧利用的规律，反映发酵的异常情况，是一个
8、重要的控制参数，也是设备供氧能力的指标。4. 产物浓度：是产量高低，代谢正常与否的重要参数，也是决定发酵周期长短的根据。5. 氧化还原电位：培养基氧化还原电位是影响微生物生长及其生化活性的因素。在限氧条件下，氧电极已不能精确使用时，氧化还原电位就成为控制发酵过程的重要参数6. 尾气O2浓度和CO2浓度 尾气中O2浓度与生产菌的摄氧率和Kla有关（发酵罐的供氧能力） CO2浓度可计算出生产菌的呼吸商，了解呼吸规律。7. 菌体RNA, DNA含量，以及ATP, ADP, AMP体系，NAD(P)-NAD(P)H体系，表示菌体生长情况，能量代谢能力，生物合成能力,三、生物参数1. 菌体浓度（生物量b
9、iomass）：菌体浓度的大小和变化速度对生化反应有影响，特别是对抗生素等次级代谢产物的发酵影响显著，菌体浓度与培养液的粘度，DO都有关。2. 菌体形态：菌体形态的改变是生化代谢变化的反映，尤其是菌丝，菌丝形态可以作为衡量种子质量，区分发酵阶段，控制发酵过程代谢变化和决定发酵周期的依据之一。,菌浓测定方法 光密度测定法 OD600660 适合于细菌、酵母 测干重 测粘度 压缩体积法（离心） 静置沉降体积法,从检测手段分可分为： 直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等 间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等,直接参数又可分为: 在线检测参数指不经
10、取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速； 离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。,二 微生物培养过程的参数检测,在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据。,参数在线检测,由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求： 插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据） 传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好） 传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏） 传感器性能要稳定，受气泡影响小。,带计算机数据采集与控制的生物反应系统,
11、P188,原理：化学或物理信号 电信号 放大 记录显示仪控制器（与设定参数比较）发出调节信号 控制器动作,项目背景,参数的离线检测,举例,鸟苷是呈味核苷酸二钠“I+G”的重要原料， 七十年代上海工业微生物研究所开始研究发酵水平：7克/升 12克/升没有形成产业肇庆星湖公司从工微所购买上述菌株，经过多年研究开发：发酵水平： 12克/升 16克/升,2000年I+G 产品首次独家面市，遇到日本冲击，同年9月投资2 .1亿的新开发厂区全面停产。 16g/L 25g/L （盈亏持平）,通过鸟苷发酵的数据采集发现：,发酵到40小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖,使发酵过程pH下降，
12、补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？ 于是进行以下一些测定与分析,（一） 利用高效液相（HPLC）分析代谢中间产物通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程,什么因素导致pH下降？,1、有机酸的积累有机酸积累 pH下降 补加氨水在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累发酵后期有机酸积累代谢不正常 会引起加入的NH4+积累，相应出现产苷速率下降。,测定以下中间物,发酵后期丙酮酸积累,2、氨基酸的积累 在有机酸分析的基础上进一步测定发酵过程中
13、不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸不断积累，并且其积累晚于有机酸和NH4+积累。,通过HPLC对氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在8小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的12.6倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是代谢流迁移所致。,3、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的增加造成了丙
14、酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酰胺合成酶（GS）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。,丙酮酸积累 氨水补加增加,NH4+积累,抑制GS,抑制TCA循环,丙酮酸积累,激活磷酸果糖激酶,EMP流量增加,恶性循环,丙氨酸积累,（二） 代谢流迁移的酶学证明 糖代谢途径关键酶 糖酵解途径（EMP） 在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶： 磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的时序分析,12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以PFK的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到40小时以后，观察到PFK相
15、对酶活增加，前面的测定也表明，丙氨酸和丙酮酸积累，更重要的是鸟苷形成速率减慢甚至停止，这表明此时通过EMP途径的糖代谢通量已有了明显的增加。,丙酮酸激酶时序分析,丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素,磷酸戊糖途径（HMP）关键酶,磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化6磷酸葡萄糖脱氢生成6磷酸葡萄糖酸内酯。,6磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析,由图可以看到，早期6磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径
16、合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持EMP和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到40小时后，6磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在HMP途径通量下降而EMP途径通量增加。,三羧酸(TCA)循环的关键酶,三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，三羧酸流量大，丙酮酸就不会积累。三羧酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。,柠檬酸合成酶时序分析,从图可
17、以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量并没有发生明显的增加。,结果表明，代谢流迁移发生在EMP和HMP之间，主要是由于EMP和HMP途径之间的分配平衡被打破所造成的。EMP途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。,丙氨酸脱氢酶的时序分析,在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。,结果加入EMP途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量,创建了全新的补料控制工艺 50L发酵罐： 17.2克/L 32克/L(60小时) 菌体细胞主流代谢流迁移问题是本项目过程优化的关键。,结 果,
