1、HLA与血小板血型,北京大学人民医院,更多医学精品 尽在医学吧 http:/ HLA生物学功能及临床应用 HLA分型方法及抗体检测 血小板血型抗原的概念及分类 血小板血型抗原抗体的检测方法 血小板血型抗原抗体的临床意义 输血对器官移植的免疫学影响 骨髓移植与输血 器官移植与输血,HLA的概念 （human leukocyte antigen）,HLA是人类白细胞抗原，是指第6条染色体短臂上一段基因和由其编码的抗原的总称 承担着机体识别自己和非己的基本免疫功能,主要组织相容性抗原 （Major histocompatibility system）,与移植排斥有关的抗原称为组织相容性抗原 能引起快
2、而强的排斥反应的抗原称为主要组织相容性抗原MHS 代表个体特异性，视作个体的“身份证”,人类白细胞分化抗原 （Leukocyte differentiation antigen LDA）,是指不同谱系白细胞在分化发育不同阶段以及活化过程中，出现或消失的表面标记,分化群CD （Cluster of differentiation,CD）,应用以单克隆抗体鉴定为主的方法，将不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原，其编码基因及表达细胞均鉴定明确者，称CD,分化群CD （Cluster of differentiation,CD）,HLA基因结构与遗传,HLA具有高度多态性 HLA-A、HLA-B
3、和HLA-C抗原，统称为HLA-I类抗原 HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP称为II类抗原,HLA基因结构与遗传,HLA基因结构分为3个区域，分别称之 HLA-I类、HLA-II类和HLA-III类基因,编码膜蛋白,膜蛋白,编码可溶性分子,HLA的生物学功能,其中心功能是对外界侵入异物的识别和排斥 对自身衰老和变异细胞的识别和清除,HLA的生物学功能,控制免疫应答 抗原呈递 T细胞选择 调节NK细胞的活性 参与妊娠免疫调节,HLA的临床应用 输血,（一）非溶血性发热反应 临床输血中占55-75%，多数是由HLA抗体破坏白细胞后释放出致热原引起输血时选择少白细胞成分输血 避免该反应的简单方
4、法就是,滤除白细胞,HLA的临床应用 输血,（二）血小板输注无效 临床中反复输血，增加血小板输注无效发生率，多由HLA抗体阳性造成，20-25%同时伴有血小板特异性抗体。 处理方法：,少白细胞成分输注 血小板特殊配型,HLA的临床应用,HLA的临床应用 器官移植,HLA能激活T淋巴细胞增殖和（或）细胞溶解，产生宿主抗移植物反应（HVGR）或移植物抗宿主病（GVHD），导致移植失败 。 与HLA最密切的器官移植是骨髓移植（BMT），HVGR和GVHD是影响骨髓存活的两个重要问题，发生的主要原因是HLA不合。,HLA的临床应用 疾病关联,HLA的临床应用 骨髓库与脐血库,BMT要求HLA-I类及I
5、I类分子匹配 由于HLA的多态性，随机人群中配型完全相合的概率极低，HLA相合的供者极难找到。 建立大规模的志愿献髓者的HLA分型数据库，即“骨髓库”，具有重要的临床意义。,HLA的分型方法,序列特异性引物（PCR/SSP） 序列特异性寡核苷酸探针（PCR-SSOP） 每个HLA等位基因中存在一个特定的核苷酸序列，它决定该HLA的多态性和型别,HLA的分型方法,人工合成的寡核苷酸探针可用于检测这些已知的多态现象 将扩增和固定的DNA标本与人工合成的DNA探针一起孵育、洗涤 再用放射性自显影技术检测 阳性反应显示出与标记探针匹配的DNA序列,Platelet Antigen Genotyping
6、: PCR-SSP,HPA-5b/b (Bra/a),HPA-5a/b (Bra/b),HPA-5a/a (Brb/b),HLA抗体检测,抗体筛选 抗体鉴定 交叉淋巴细胞毒试验本实验主要用于骨髓移植配型、肾移植配型和血小板配型,血小板血型,血型是所有血液成分的遗传性标志。,血型的发现,红细胞血型：1900年，Landsteiner发现ABO血型。 血小板血型：1959年，Van Loghem发现Zwa血型 白细胞血型：1960年，Lalezari发现HNA1965年，Bassuat发现HLA,血小板血型的发现,HPA-1血型系统：1959年，van Loghem HPA-2血型系统：1962年
7、，van der Weerdt HPA-3血型系统：1980年， HPA-4血型系统：1985年，Friedman HPA-5血型系统：1988年，Kiefel,血小板血型系统,血小板表面具有复杂的血型抗原 由遗传决定,血小板血型抗原分类,血小板血型抗原主要有二大类（除外药物抗原）：,血小板特异性抗原 (HPA),血小板相关抗原(HLA),共有的,独特的,血小板血型抗原,（一）血小板相关抗原： 血小板表面存在的与其他细胞或组织共有的抗原 包括组织相容性抗原（HLA）和红细胞ABO血型系统相关抗原,血小板血型抗原,（二）血小板特异性抗原 (HPA) 血小板特有的抗原 表现独特的遗传多态性 在其它
8、细胞和组织上不能发现,血小板血型抗原,ABO系统血型抗原,血小板表面存在红细胞ABO系统的A抗原和B抗原，血小板上没有RhD抗原ABO型不合的血小板输注，影响血小板寿命,尽量选择ABO同型血小板输注,血小板血型抗原,HLA血型抗原 血小板存在HLA-A和B位点的一类抗原 尚未发现DR、DP、DQ等二类抗原 应用氯喹或酸溶液在0处理血小板，能够除去血小板表面HLA抗原，这为应用处理后血小板治疗血小板输注无效提供了重要依据,血小板血型抗原,HPA抗原（Human platelet antigen, HPA） 人类血小板特异性抗原是位于血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）上的抗原表位。
9、血小板特异性抗原是通过相应抗体的检出而发现的,血小板特异性抗原的命名,血小板特异性同种抗原系统国际命名为人类血小板抗原系统（HPA）。 不同的抗原系统按发现顺序用数字编号 2个对偶抗原组成的遗传系统中,对偶基因分别用英文小写字母a和b表示。 只有在2个对偶抗原全被检测出来后,才能被称为系统。 目前被国际输血协会确认的血小板特异性抗原有7个系统共28种抗原，正式命名为HPA-1HPA-6，HPA15。,PNC(血小板命名委员会),2003年国际输血协会（ISBT）和国际血栓和止血协会（ISTH）建立了血小板命名委员会（The Platelet Nomenclature Committee，PNC
10、） 。,血小板特异性抗原的分子生物学,在已知其分子机理的28个血小板抗原中，其基因多态性大多是由于相应血小板膜糖蛋白结构基因中的SNP(single nucleotide polymorphism)引起，而致相应位置的单个氨基酸变异所致。,主要的多态性靶HPA：7个系统，HPA-16,15,血小板血型检测技术,近年来，随着分子免疫学、分子生物学的发展和各种标记技术在医学领域的应用，血小板血清学检测方法有了很大进展，一些分子生物学技术也开始应用于血小板血型分型。,血小板血型检测技术,除血小板特异性抗原HPA外，血小板表面的HLA、ABO等抗原具有重要临床意义。 由于ABO血型可用相关红细胞方便地
11、检测，故临床上对血小板血型的检测主要集中在HPA和HLA的检测上。,血小板抗原抗体血清学检测,也称血小板血型相容性检测 同红细胞血型血清学检测一样，包括血型鉴定、抗体筛检和鉴定，以及交叉配血 微柱凝集间接免疫反应技术使血小板免疫学工作有突破性进展,血小板抗原抗体血清学检测,固相红细胞吸附试验（SPRCA） 修饰的抗原捕获ELISA分析(ELISA,MACE) 单克隆抗体固着血小板抗原分析（MAIPA） 流式细胞术( FCM ) 微柱凝胶间接免疫分析技术（MGIA） 基因检测技术,固相红细胞粘附实验（SPRCA）,AHG致敏红细胞作为指示细胞 Commercial Assay (Capture
12、P) ; Rapid test 敏感性和特异性低。 使用完整血小板作为抗原，不能分辨抗体类别 主观性比较强，通过红细胞的凝集作为判断标准。 试剂有效期短。,Capture-P,血小板抗原与抗体,自身抗体,同种抗体,抗原抗体复合物,洗涤,静置4小时或离心,抗体,抗原,SPRCA,包被了抗人IgG的指示红细胞,阳性反应,阴性反应,血小板抗体检测,抗体分类一类主要是针对人类组织相容性抗原HLA类抗原的抗体,即血小板表面相关抗体(PAIgG) 一类是针对GP抗原的血小板特异性抗体( PBIgG),血小板特殊配型,双盲交叉配血：微量淋巴细胞毒试验 目的：血小板特殊配型，避免无效输注 原理：结果：选择反应
13、阴性供者输注,患者血清,供者Lc,补体,着色阳性,伊红染色,细胞穿洞,非着色阴性,血小板交叉试验,最有效、经济、简便 交叉试验是一种非常好的解决血小板输注无效的方法,血小板抗体发生率,检测223 例血小板输注无效患者 血小板抗体阳性80例 （35.87%）（20-50） HPA抗体1例 （占1.25%），HLA抗体75例 （占93.75%），同时含有HLA和HPA 抗体者4例（5%）,输注无效绝大多数由HLA抗体引起,血小板输注无效的处理,血小板输注无效（首先排除非免疫因素及血小板质量低下）HLA交叉配血（HLA抗体）仍输注无效抗体特异性预测交叉配血配不上的 选择供者,血小板特殊配型,血小板H
14、PA抗体检测,血小板抗原检测,血小板血型的主要临床意义,免疫性血小板减少症 自身免疫性血小板减少症（AITP)同种免疫性血小板减少症 （ITP）药物诱导免疫性血小板减少症 (DIIT),血小板抗原同种免疫的反应机制,血小板糖蛋白被自身或同种异基因效应T细胞和B细胞所识别，产生相应的抗体，结合到相应的血小板抗原上 巨噬细胞表面的Fc受体与抗体分子的Fc片段结合后，在脾脏内血小板被巨噬细胞吞噬，引起血小板减少症,自身免疫性血小板减少症（AITP),AITP比自身免疫性溶血性贫血（AIHA)更常见。 PAIgG检测是其最有价值的试验。但是PAIgG并非特异，其阳性诊断价值仅为46%，阴性诊断价值为8
15、2%。,同种免疫性血小板减少症,新生儿同种免疫性血小板减少症 （NAIA ） 输血后紫癜 （PTP） 血小板输注无效 （PTR）,NAITP Ethiology,新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜 （NAIA ）,NAIA类似于红细胞血型系统的HDN 80%是由HPA1a抗体引起的 NAIA的死亡率约为10%，第一胎的发生率约为2059%。 产前诊断对预后非常重要。,血小板输注无效 （PTR）,约有2050%白血病患者，80%再障患者在长期输注血小板后，发生血小板输注无效。,血小板输血效果评价,出血症状改善 凝血时间减少 输血后1h和24h血小板数增加,血小板输注无效的判定指标,实际血小板回收率
16、（PPR）是通过检测患者输注血小板1小时或24 小时后的血小板计数进行计算。用以评价血小板输注后的实际效果。,实际血小板回收率,PI(109/L) 血容量（L） PPR = 100%N(1011) 2/3 PI = 输注后的血小板计数输注前计数N = 输入血小板的绝对数量2/3= 输入的血小板约1/3进入脾脏血小板贮存池,实际血小板回收率,以下应考虑血小板输注无效：输注1小时后 PPR 60 输注24小时后 PPR 40,血小板输注无效的判定指标,血小板计数增加校正指数（CCI） （CCI ,corrected platelet count increment)是依体表面积计算，以期减少个体差
17、 异的影响而准确评估输注效果。,血小板计数增加校正指数,PI(109/L) S(m2) CCI = N(1011) S = 0.0061H(cm) +0.0128W(kg)+0.01529 S = 患者体表面积 H= 患者身高 N= 输入血小板的绝对数量 PI = 输注后的血小板计数输注前计数,血小板计数增加校正指数,以下应考虑血小板输注无效：输注1小时后 CCI 10 输注24小时后 CCI 5,判断原则,不成功输注：1小时 CCI10PPR60%24小时CCI5 PPR40%如果CCI或PPR不能得到，则输后血小板增加5109/L(输注1个治疗量）可作为输注无效指标。,影响血小板输注的因素
18、,非免疫因素 血小板的质量 发热感染 弥漫性血管内凝血(DIC) 脾肿大 骨髓移植,免疫因素 红细胞相关抗体 HLA抗体(占7080%) 血小板特异性抗体(HPA抗体) 与药物相关抗体 自身抗体,ABO血型抗体,ABO血型系统抗体在PTR中的作用经常被忽视。事实上，抗A、抗B可以缩短血小板寿命，也是引起PTR的原因。 （正常人血小板存活期为8-11天），,HLA抗体,是引起免疫性PTR的主要原因。 血小板上的HLA-I类抗原不足以引发抗体产生，白细胞的污染是输注血小板后产生HLA抗体的主要原因 。 因人群差异，在输注未去除白细胞的血液的病人中，30100%可产生HLA抗体。,HPA抗体,输注去
19、白细胞红细胞或血小板，HPA抗体产生概率仅为1.5%。 HPA抗体多与HLA抗体同时存在。,血小板输注无效对策,许多因素涉及血小板输注无效，一些临床因素和可能的致免疫性反应因素的调查，对于制定一个好的对策非常重要。,血小板输注无效对策,输注ABO相合的高质量的血小板，以防止因ABO抗体或血小板质量问题而引起的输注无效。 对于一些因血小板消耗增加而致的输注无效（如发热、DIC等），缩短输注时间比增加输注量更重要。 对于脾肿大，则应以增加输注量为主。,血小板输注无效对策,如果存在自身抗体，用激素、免疫抑制剂或IVIg、血浆置换治疗，可有疗效。 原因不明的PTR，往往应考虑药物性抗体，停用某种药物或
20、换药是首选。,血小板输注无效的诊治对策,对策,HLA抗体筛选和血小板特殊配型 HLA抗体筛选阴性，可随机输注； HLA抗体阳性，选择交叉配型方法，以选择相关HLA抗原阴性的血小板进行输注。 特配输注无效，则考虑检测HPA抗体，特别是在排除非免疫因素引起血小板输注无效的情况下。 尽量选择ABO血型一致的血小板。,输血对器官移植的免疫学影响,主要表现在以下几个方面： 致敏反应 诱导免疫耐受 介导输血相关性移植物抗宿主病,输血对器官移植的免疫学影响,致敏反应 移植前的输血，诱导受体产生HLA抗体，对供者组织抗原特异性的T细胞致敏 移植后，因表达类似组织抗原移植物的再次刺激，诱发强烈的排斥反应 急性排
21、斥反应最为常见，多发生在移植后7-90天，以细胞免疫应答为主 慢性排斥反应多发生在移植后数月或数年，已体液免疫为主。 除排斥反应外，血小板输注无效和发热反应,滤除白细胞,输血对器官移植的免疫学影响,诱导免疫耐受 输血可降低机体的免疫功能，造成T细胞对抗原刺激的不敏感、NK细胞数量的减少以及巨噬细胞吞噬和趋化能力的下降，诱导免疫耐受 输血诱导的免疫耐受主要见于肾移植,输血对器官移植的免疫学影响,介导输血相关性移植物抗宿主病 GVHD是最为严重的输血并发症，死亡率极高 输入含免疫活性淋巴细胞的血液后，淋巴细胞经受体组织抗原的刺激激活，大量增殖，攻击和破坏受体组织细胞，导致多脏器损害甚至死亡 亲属间
22、输血、新鲜血液均易发生TA-GVHD，与HLA单倍型相同及淋巴细胞活性有关 移植患者、亲属间输血应输注经辐照的血液成分，以预防TA-GVHD,骨髓移植与输血,骨髓移植成功后实现血型转换 供受体血型不合的输血会延迟造血重建、影响红细胞发育和生成，甚至引起严重溶血或死亡 移植前后全过程的血液免疫学检测和评估对安全、有效的输血具有重要意义 连续的、准确的血型抗体滴度检测为移植过程的输血提供有力证据 临床与实验室相结合,肾脏移植与输血,早期肾移植输血：从否定到肯定时期，认为移植前多次输血可因免疫耐受而显著提高移植肾的存活率 近年来由于免疫抑制剂的广泛应用，术前随机输血已被临床逐渐弃用 去白细胞血液的选
23、择，大大降低了HLA抗体产生和急性排斥反应的发生,肝脏移植与输血,实体器官移植中，肝移植的输血最为复杂、输血量最大 随着技术的完善，肝移植术中失血量和输血量已显著下降 肝移植输血的主要目的是 维持组织氧供 恢复机体的凝血功能 维持有效的容量负荷,肝脏移植与输血,输血评估与输注原则 大量输血降低肝移植患者的存活率，还伴有许多潜在风险，须严格掌握输血指征，综合考虑机体对贫血的耐受 大量输血增加外源性感染机会，围术期感染率上升 限制性输血（Hb70g/L）比开放性输血（Hb100g/L）具有更好的效果,肝脏移植与输血,成分输血推荐比率 2单位红细胞+1单位FFP+200ml晶体液 输血血型 输血血型
24、一般选择患者血型，特殊情况依临床及免疫血液学结果综合判断,肝脏移植与输血,肝移植术大多存在凝血功能障碍，须针对缺乏的血液成分选择性补充 ，术前应进行评估及纠正 术中大量输血导致稀释性凝血因子和血小板缺乏，必要时补充,肝脏移植与输血,不规则抗体筛检和特异性鉴定对于安全输血极为重要，可有效防止溶血反应等严重并发症 ABO血型不合的肝移植，植入后，供者B淋巴细胞分泌的血型抗体能溶解受者或输入的红细胞引起溶血。因此，对ABO血型不合的患者，肝移植术后应进行连续免疫血液学监测。,总结（HLA）,HLA承担着机体免疫识别功能 临床输血中非溶血性发热反应 、血小板输注无效 、GVHD等均与HLA相关，预防选
25、择少白细胞制品 HLA抗原匹配程度是器官移植与BMT成功的关键 输血和妊娠是引起HLA同种免疫两种主要的危险因素 滤除白细胞和辐照灭活白细胞可减少HLA免疫,总结（血小板血型）,血小板抗原分为三类：血小板相关抗原、血小板特异性抗原和药物抗原。相关抗原与ABO血型系统及HLA有关 血小板输注无效与免疫、非免疫因素有关 HLA抗体筛选和血小板特殊配型是解决PTR的有效措施 妊娠和输血是导致同种异体免疫的主要原因 滤除白细胞、辐照血液和血小板特殊配型等可减少同种免疫的发生,总结（器官移植）,输血诱导受体产生HLA抗体导致排斥反应 输血可降低机体的免疫功能，诱导免疫耐受 输血介导TA-GVHD，选择辐照制品预防 连续、准确的血型抗体滴度检测为移植过程的输血提供有力证据 器官移植的输血原则是：维持组织氧供、恢复机体的凝血功能和维持有效的容量负荷,谢 谢！ 北京大学人民医院 田文沁 ,
