1、浙江大学医学院附属第一医院 传染病诊治国家重点实验室,2008年5月10日,肝衰竭机制和治疗研究进展,李兰娟,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝衰竭患者病情危重 极度乏力，消化道症状，腹胀或腹水； 黄疸进行性加深（TB171umol/L或每天上升17umol/L）； 明显出血倾向，PTa40%； 肝性脑病和/或肝脏进行性缩小。 肝细胞大片坏死,各种类型肝衰竭 发病机制、关键物质尚未明确 内科综合治疗：病死率达80如何提高疗效是国际性难题,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝衰竭的定义,肝衰竭是由多种因素引起肝细胞严重损害，导致其合成、解毒和生物转化
2、等功能发生严重障碍，出现以黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病和腹水等为主要表现的一种临床综合征。,中华医学会感染病分会、肝病分会肝功能衰竭与人工肝学组. 肝功能衰竭诊疗指南. 中华传染病杂志.2006，24：422,我国肝衰竭诊疗指南已颁布,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝衰竭的分类,中华医学会感染病分会、肝病分会肝功能衰竭与人工肝学组. 肝功能衰竭诊疗指南. 中华传染病杂志.2006，24：422,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝衰竭的治疗,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,人工肝研究进展,肝衰竭治疗研究进展,人工肝治疗原理
3、,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,人工肝分型,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,非生物人工肝支持系统(ALSS)设计原理,血液灌流：清除中分子量有毒物质 血浆吸附：吸附胆红素、毒素 血液透析 平衡水、电解质，去除代谢产物 血液滤过 清除中、小物质有毒产物 血浆置换：清除病毒和有毒物质，补充蛋白质、凝血因子，调整血氨基酸比例,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,选择性血浆置换,普通血浆分离器用于重型肝炎的局限性 血浆置换后球蛋白明显下降 原因是补充的新鲜血浆的球蛋白20g/L(正常值为20-35g/L 将HGF等有益的物质无选择性
4、的除去，可能会影响到肝细胞的再生,EC-4A 选择性血浆分离器,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,小孔径(0.03 m ) 血浆分离器用于肝衰竭治疗的优点 （即选择性血浆置换） *,由于其对球蛋白的筛选系数，避免了血浆置换后的低胶体渗透压及低球蛋白血症 减少了置换的血浆量，一次治疗节约1000的血浆 由于HGF在体内以分子量200万道尔顿的形式存在，利用小孔径血浆分离器的应用减少了肝细胞生长因子的减少 小孔径血浆分离器在应用中的另一个优点是：跨膜压非常平稳,*Li LJ, et al. Ther Apher 2005, 9(5):424-429,内科学（传染病）国家重点学
5、科 传染病诊治国家重点实验室,进展血浆透析滤过 Plasma Dia-filtration (PDF),将血浆置换与血液透析、血液滤过等结合起来联合应用 清除向血管内移动较慢的物质 可设定脱水量，控制体内水分量 血浆使用量减少，仅为PE使用量的一半（1600ml）,补充液,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,技术难点,出血与灌流器凝固通过检测ACT和跨膜压调节肝素量（10-108mg)鱼精蛋白量（10-50mg) 低血压与心功能负荷过重分离血浆速度（20-30ml/min)血液流量（60-130ml/min)进出量平衡,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室
6、,建立了完整的ALSS技术规范和不同组合的治疗方法 通过有效调节ALSS压力、速度、出入量平衡等，解决了低血压、心功能不全的难点 通过合理调节肝素、鱼精蛋白使用量，克服了出血、灌流器凝固等难点 摸索出血浆置换量的最佳范围和治疗的最佳时机,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,非生物型ALSS方案组合,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,ALSS治疗取得显著疗效,*Li Lanjuan,et al. Chinese Medical Journal, 2001, 114(9):941-945,肝功能明显改善 P0.001,内毒素显著下降 P0.005,蛋氨酸显
7、著下降 P0.001,BCAA/AAA比值上升P0.05,治疗前,治疗后,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,ALSS治疗重型肝炎疗效,自1986年以来，浙医一院应用ALSS治疗重型肝炎1000余例（3600余例次），显著降低重型肝炎病死率,重型肝炎的治愈好转率,不同分期重型肝炎的治愈好转率,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,典型病例,女性，30岁，产后罹患重型肝炎、肝性脑病3期，分别于入院后1、2、4天接受3次人工肝治疗，肝功能和全身情况改善明显,康复出院,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊
8、治国家重点实验室,3次ALSS治疗PT变化图,3次ALSS治疗ALT、TB变化图,天,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,典型病例,患者，男性，10岁，因 “白癜风”，服用“驱白巴布期”引起药物性肝衰竭，“进行性眼黄，尿黄1周，神志欠清1天”入院。父母一度要放弃治疗，慕名入住我院后3月17日接受 血浆置换血浆灌流治疗，20日接受选择性血浆置换后完全康复出院。,研究对象：存活组117 例患者 ( 存活时间1个月 )和死亡组172 例患者 (存活时间0.05) 改善程度：无论24h还是72120h, 两组均改善，但死亡组均明显小于存活组 (p0.05), 特别是72120 h.
9、 根据24h、72120h改善程度构建两个logistic 回归模型预测1个月存活率: 72120 h明显优于 24 h (92.4% vs 66.4%). 结论:,The curative effect of ALSS on 1-month mortality in AoCLF patients after 72 to 120 hours Int J Artif Organs 2007; 30: 10,人工肝疗效早期评估,Biochemical parameters Improvementpost-ALSS at 24 h post-ALSS at 72120 hSurvival group
10、 Control group Survival group Control groupINR -0.85 4.36 -1.47 2.82 -0.68 1.78 * 0.03 2.67 Albumin (g/L) 1.24 6.11 1.34 21.99 2.28 3.28 0.86 15.92 Globulin (g/L) -5.11 9.71 -4.35 16.00 -3.86 16.70 -2.04 16.41 ALT(U/L) -218.07 803.01 -126.9 334.88 -194.14 802.66 -70.57 365.34 AST(U/L) -113.90 188.68
11、 -80.82 434.31 -71.99 375.67 -30.61 169.80 CHE (U/L) 2290.26 3227.12 2556.35 3120.39 1996.97 2991.36 1048.98 4699.76 Tbil (mol/L) -95.65 117.68 -84.32 133.84 -81.78 233.33 -38.48 140.89 TB (mol/L) -331.04 208.93* -252.86 222.30 -277.34 234.17* 23.39 264.56 Cre (mol/L) -40.57 7.33* -23.99 13.89 -31.8
12、6 46.89* -6.99 13.96 Urea (mmol/L) -1.28 1.82 -1.90 9.23 -1.18 4.85 -0.64 1.79 (MELD) score -2.32 3.60 -2.27 4.08 -2.21 1.20* 1.02 1.67,AoCLF 患者预后取决于人工肝后 72120 h肝性脑病、TB、INR、CRE 改善程度,人工肝治疗后获得新生的病人,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,2000年以来2002年，中华医学会感染病分会肝衰竭与人工肝学组成立推出人工肝治疗指南，进一步规范了我国非生物型人工肝的临床治疗,2002年人工肝学组第
13、一次会议,2006年，感染病分会与肝脏病分会联合推出肝衰竭诊疗指南，对肝衰竭的临床诊疗具有重大指导意义,人工肝治疗的标准化和规范化,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,全国非生物型人工肝开展情况（1）,截至2005年，我国大陆所有省市均已开展非生物型人工肝治疗 治疗例数：从2000年起至今共治疗例数20662例 治疗效果：重肝治愈好转率高至60%以上,全国人工肝开展单位数情况,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,全国非生物型人工肝开展情况（2）,治疗方法 ALSS：14932例 血浆置换：4373例 血液滤过：290例 活性炭/树脂吸附：71例 胆红素吸
14、附：426例 MARS ：450例 混合人工肝：120例,我国人工肝治疗重型肝炎例数构成,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,生物型人工肝研究进展,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,生物型人工肝,优点 清除有毒物质 补充活性物质 存在问题 缺乏代谢功能 血浆来源紧张限制应用,优点 具有合成、代谢和转化功能 关键技术与难点* 缺乏理想肝细胞源 缺乏高效生物反应器,非生物型人工肝,*Strain AJ,et al.Science,2002,295：1005-9,生物型/混合型人工肝是国内外研究的热点,混合型人工肝,优点：整合两者优势 关键技术与难点：二者有
15、机结合的装置及参数等问题,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,生物型/混合型人工肝国外研究现状,国外生物型/混合型人工肝起步于20世纪80年代后期迄今有5种生物型/混合型人工肝进入IIII期临床研究国内20世纪90年代后期，浙江、重庆、广东、江苏、北京等地相继开展BAL、HAL研究,研究热点： 安全、有效的人工肝用肝细胞源 高效的生物反应器 BAL、HAL系统优化及装置研制,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,常规二步灌流法对大规模分离肝细胞的质量不理想 添加Hepes和Dispase等灌流液，进行四步灌流分离肝细胞获满意结果,原代肝细胞分离方法的研究四
16、步灌流法的建立,Dispase液灌流,含Hepes的平衡盐缓冲液预灌流,EDTA液灌流,胶原酶液灌流,DNase洗涤液洗涤， 收集肝细胞悬液,四步灌流法和二步灌流法的流程图,灌流操作图,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,四步灌流法提高了肝细胞活率（96%）、得率（5.3X107/g）和贴壁率（90%）,申请发明专利：生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法(200410084625.7)、用于生产人工肝细胞的试剂(200410084626.1)、一种肝细胞冻存液（200410089587.4）,新方法为人工肝及细胞生物学研究提供高质量的肝细胞,新鲜分离的肝细胞,培养24h后的肝
17、细胞,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,转染,筛选,正常人肝细胞,生物学功能鉴定,永生化肝细胞克隆,SV40LT-pcDNA3.1(-) 重组载体,建立人源性永生化肝细胞系HepLL,人源性永生化肝细胞系构建研究,传代培养,已稳定传 47 代 HepLL具有原代肝细胞相似的生物学特征和功能,HepLL在裸鼠脾内移植，表达肝细胞生物特性,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,在建成HepLL基础上，又建立人源性永生化肝细胞系2株（HepLi2、3）和猪永生化肝细胞系3株（HepLP1、2、3） HepLL系列肝细胞系已被多家研究机构（上海交大、上海肿瘤研究
18、所等）应用于科学研究,人源性永生化肝细胞系为人工肝研究提供了潜在肝细胞源，并为肝细胞移植和体外药物筛选提供新的细胞模型,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,利用经胶原改性的乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)为构建仿生支架进行原代人肝细胞培养 PLGA支架可明显促进肝细胞的贴壁和增殖 提高肝细胞白蛋白的合成、氨的清除与尿素合成,肝细胞体外组织样培养研究,Li J, Li L, et al.ASAIO J. 2006; 52 (3): 321-7.,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,肝细胞体外大规模培养、冻存研究,可逆性永生化 肝细胞,评价肝细胞活性和功能 肝
19、细胞形态、超微结构 肝细胞数量 肝细胞的活率、贴壁率 白蛋白合成量 细胞色素P450酶活力（安定转化试验）等,新型转瓶培养系统,程序降温、液氮储存,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,微囊化肝细胞的大规模培养,AC(海藻酸钠壳聚糖)微囊包裹HepLL细胞 置于转瓶培养仪匀速旋转培养 Hep LL细胞随着时间延长，集聚成球，逐渐增多增大,微囊化肝细胞制作,微囊化肝细胞转瓶培养,微囊化HepLL细胞核仁明显，富含线粒体、内质网及糖原颗粒，可见紧密连接及毛细胆管样结构,毛细胆管样结构,细胞间紧密连接,B,富含内质网、线粒体,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,
20、生物反应器研究,理想生物反应器 膜或支架材料等具有良好的生物相容性，便于肝细胞黏附、聚集 良好的物质交换效能 易于“放大”，能够容纳至少1010个肝细胞,肝细胞与患者血浆（血液）进行物质交换的场所,生物复合材料已经成为生物反应器研究的热点之一,生物人工肝系统构成示意图,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,微囊化肝细胞悬浮培养反应器体外评价,微囊化肝细胞悬 浮培养反应器,微囊化肝细胞悬浮培养生物反应器：（正在进行体外评价）,生物支架式生物反应器 PLGA支架、PLGA/CS支架正在研究中（浙大高分子材化系合作）,生物支架式反应器,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重
21、点实验室,生物型人工肝动物实验研究,国家自然科学基金面上项目（编号：30270369）资助,建立猪急性肝衰竭动物模型 进行生物型人工肝疗效和安全性评价研究,猪肝组织呈现出血性坏死,急性肝衰竭猪动物模型,两只猪正在接受BAL治疗,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,生物型人工肝能有效地改善肝衰竭猪肝功能生物型人工肝延长肝衰竭猪存活时间 急性肝衰竭模型组：487h 装置对照组：438h 人工肝治疗组：10623h,Li LJ, et al. Journal of Hepatology, 2006,24:317-324 Li LJ, et al. International Jo
22、urnal of Artificial Organs, 2003 ,26:507-513 专利一种杂合型人工肝装置（ZL03255510.5）,受试动物生存曲线,* 与AHF组、Sham BAL组比较，P 0.01,* 与AHF组、Sham BAL组比较，P 0.05,* 与AHF组、Sham BAL组比较，P 0.01,* 与Sham BAL组比较，P 0.05,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,混合型人工肝临床研究,引进中空纤维管式生物反应器 选择中国实验用小型猪为肝细胞供体 治疗15例慢性重型病毒性肝炎患者，11例好转出院,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国
23、家重点实验室,重肝患者在接受混合型人工肝治疗,混合型人工肝治疗后康复患者,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,（三）人工肝支持系统联合肝移植 救治晚期重型肝炎,术前人工肝应用 能使患者更易耐受手术有效改善一般情况及内环境紊乱降低ALT和胆总素 暂时替代肝脏功能以待择期肝移植 术后人工肝应用 原发性移植肝无功能 排斥反应 肝移植术后合并多器官功能衰竭,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,ALSS-LT组生存时间较ALSS组和non-ALSS-non-LT组明显延长（P 0.01）,ALSS联合肝移植显著延长生存时间1月生存率87.3，半年生存率73.9最长
24、存活已超过68个月，恢复正常工作,生存率比较,1,6,20,40,60,80,100,0,时间（M）,生存率（）,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,典型病例,男性，42岁，罹患重型肝炎、肝性脑病3期，分别于移植前21、17、14、7、1天 接受5次ALSS治疗，肝功能和全身情况改善明显,顺利实施肝移植,恢复良好.,五次ALSS治疗TB变化图,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,入院,肝移植前人工肝治疗,肝移植手术,切除的肝脏,供肝,术后康复,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,典型病例,患者女性，2岁，因香港旅游07.10.3进食海
25、鲜后出现发热，乏力，纳差，恶心，服用泰诺，10.4又出现发热，查肝功能：ALT8076U/L，AST5970U/L，TB87umol/L，DB47umol/L。CT：肝脏脂肪浸润10.8肝功能：ALT8185U/L，TB131.7umol/L。CT：肝脏肿大，脾肿大，少量腹水。诊断为急性肝衰竭。,2007年10月10日7pm血浆置换。 2007年10月11日行血浆置换血液灌流，当晚接受活体肝移植。 肝移植20余天后出院。,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,问 题 与 展 望,肝衰竭依然是临床诊治的重要问题 肝衰竭的发生发展机制需深入研究 非生物型人工肝，人工肝联合肝移植治疗肝衰竭疗效确切 人工肝尤其是生物型人工肝用肝细胞源和生物反应器研究有待突破,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,传染病诊治国家重点实验室,临床基地 2万余平方米 8个病区，256床传染病病房 实验基地 7,000平方米（含P3实验室） 大型实验仪器设备70余台（件），约6000余万元,具有完善的科研支撑体系 8个研究技术平台 16个研究工作室,内科学（传染病）国家重点学科 传染病诊治国家重点实验室,谢谢！,传染病诊治国家重点实验室大楼,
