1、祁 腾四川省疾病预防控制中心聚合酶链式反应（ PCR）检测鼠疫菌特异性基因1PCR原理n 变性：将作为模板的 DNA链加热到 95 ，使双链解旋成为单链。n 引物附着：当温度下降到一个较低的温度时，加入的引物与模板链结合。 n 链延伸：温度再次升高到多聚酶的作用温度时，耐热的DNA多聚酶催化附着在模板链上的引物延长 ,成为一条新的 DNA链。 23注意事项n防止污染：专用或单独的实验室；更换手套；试剂应小份储存；吸头离心管等需洁净；尽量最后加模板等n阳性对照和阴性对照：每次实验均需包含阳性对照和阴性对照。4PCR各基本成分n Buffer： 镁离子浓度一般为 1.5mM PCR反应需要由缓冲液
2、提供一定的离子环境。镁离子浓度为 1.5mM。 镁离子浓度可以调节来改善 PCR的质量 。一般说来，降低镁离子浓度能改善特异性，而在一定范围内， 升高镁离子浓度可增加灵敏度 。5PCR各基本成分n 引物： 是 PCR特异性反应的关键，引物应有特异性。 长度常为 20bp左右，扩增跨度以 200-500bp为宜， G+C含量以 40-60%为宜， ATGC最好随机分布。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补。引物和模板之间在引物的 5侧可有个别不配对碱基。 3端碱基应严格要求配对。 引物中有或能加上合适的酶切位点。 引物量： 每条引物的浓度 0.1 1mol/L，引物浓度偏高会引起错配和非
3、特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 通常配制成 100M的储存液，储存在 -20 ，临用时稀释成 10M的使用液。6PCR各基本成分n模板： 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR成败与否的关键环节之一。传统的 DNA纯化方法通常用 SDS和蛋白酶 K处理标本 。 现在一般用试剂盒提取 。一般检测标本，可采用快速简便的方法处理（如 沸水浴 等），直接用于 PCR扩增。PCR对模板浓度的要求并不严格。7PCR各基本成分n底物（ dNTP)： 合成 DNA的原料为 4种三磷酸单核苷酸。PCR反应中使用的浓度为 50 200mol/L 。 一般为 10 mM的混合液，可保存在 -20 。应小
4、量分装， 多次冻融会使 dNTP降解。8PCR各基本成分n Taq DNA聚合酶通常使用的酶量为 2单位， 酶量过多会产生非特异产物，过低则合成产物量减少 。9鼠疫 PCR反应（ 25l ）n无菌去离子水 13.5l n10x缓冲液 2.5lndNTPs (每种 2.5mM) 2ln引物（ 1F、 1R、 2F、 2R） 各 1l n内部对照模板 (IC) 1ln待测标本 1l nTaqDNA多聚酶 1l10鼠疫 PCR循环条件n 预变性 95 5min n n 95 1minn 55 1min 30个循环n 72 1minn 延伸 72 5minn 共 1小时 40分 11n变性温度与时间n
5、退火温度与时间Tm值 (解链温度 )=4(G+C) 2(A+T)复性温度 =Tm值 -(5 10 ) n延伸温度与时间n循环次数PCR条件12PCR反应特点n特异性强n灵敏度高n简单、快速n对标本的纯度要求低13PCR扩增产物的分析n凝胶电泳分析n酶切分析n分子杂交n核酸序列分析14利用 PCR技术检测鼠疫菌的特异序列n选择目的基因： 从疑似鼠疫的标本中检测鼠疫菌时，以鼠疫菌的 fra及 pLa二基因的片段作为 PCR扩增的目标基因。 FI抗原：是一种糖蛋白，是鼠疫菌的特异性和保护性抗原，具有抗吞噬能力。Pla（凝固酶和胞浆素原活化因子）：两种活性属于同一多肽，这两种活性的表达受作用时温度的控
6、制，但与细菌生长的温度无关。 28 时，显示高度的凝固酶活性，而在 37 时，则主要显示纤溶活性。凝固酶活性主要在蚤体内形成菌栓时起作用，而纤溶活性则在 37 宿主体内起作用。15n引物设计n模板的制备和处理菌株：提取质粒或染色体 DNA标本：沸水浴n防止假阳性：用 dUTP代替 dTTP，实验前用尿嘧啶特异的 N糖苷酶处理标本n防止假阴性：使用内部对照16在鼠疫监测中的应用前景非典型鼠疫菌的检出和鉴定直接从标本中检出鼠疫菌特异序列 假阳性率高； 有一定的假阴性率。17带内部对照的鼠疫 PCR实验的原理和使用18PCR已得到了广泛的应用，尤其对于致病微生物的检测有着重要的作用。但是， PCR方
7、法也有它的不足之处，由于交叉污染或者非特异性扩增，以及反应抑制剂等多种原因，常会出现假阳性或假阴性的结果 。为了避免假阴性的发生，需对 PCR方法设计内部对照 。19实验方法 20结果判读n电泳后显示符合 249 bp、 456 bp及 645 bp长度的3条带型者为阳性 ； 显示一条目标条带与对照条带者为鼠疫弱毒菌 ； 只显示 645 bp一条带者为阴性；无扩增条带者为假阴性 ，应改变对标本的处理方法，再行检测。n显示多数、不规则条带，并与上述预计长度均不相符者为阴性。n在疫源地内首次检出阳性结果时扩增产物应测序核实；获得正确对照结果但目标带长度不符，或在出现目标长度的条带同时出现额外条带时
8、，应测序核实。21n应用多重方法来检测鼠疫菌，所选取的扩增区域都为鼠疫菌的特异区域，可有效地将鼠疫菌与其它细菌相鉴别，具有较高特异性。n本实验中使用了内部对照，可有效的防止假阴性结果。n本法操作简便，整个实验过程可在数小时内完成 。22反 应 管 1 反 应 管 2 反 应 管 3 反 应 管 4无菌去离子水（ l） 13.5 13.5 +1 13.5 +1 13.5 +210buffer（ l） 2.5 2.5 2.5 2.5dNTPs混合物（ l） 2 2 2 2引物 1（ fraF）（ l） 1 1 1 1引物 2（ fraR）（ l） 1 1 1 1引物 3（ plaF）（ l） 1 1 1 1引物 4（ plaR）（ l） 1 1 1 1内部 对 照模板（ l） 1 1 0 0待 测 模板（ l） 1 0 1 0Taq DNA 聚合 酶 （ l） 1 1 1 123645bp456bp249bp反应管 1 反应管 2 反应管 3 反应管 424谢谢！25
