维生素类药物的分析课件PPT.ppt

1、维生素类药物的分析 The Analysis of Vitamines,药物分析技术 Technology of Pharmaceutical Analysis,维生素是维持人体正常生理机能所必需的生物活性物质。是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物资。 人体不能合成维生素。它们的结构不属于同一类物质，有些是醇、酚、酯，有些是醛、胺、酸，各自具有不同的理化性质和生理作用。一般按照溶解性将维生素药物分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类。 维：维持；微量 如果人体缺少某种维生素，就会引起维生素缺乏症，而影响人体的正常生理机能。例如: VA 缺乏夜盲症VB1缺乏脚气病,脂溶性fat-soluble

2、 vitamin ： 水溶性water-soluble vitamin ：,按溶解性分类Classification,B族（ B1、B2、B6、B12等） vitamin B group(such as B1, B2), VC 、烟酸（胺）、叶酸、泛酸等,VitA、D2、D3、 E、K1 等,VitM,（VitPP）,pantothenic acid,folic acid,nicotinic acid,第一节 维生素A的分析,一结构与性质 1 化学结构structure,-H 维生素A醇Vitamin A (VA1，VA retinol) -COCH3 维生素A醋酸酯Vitamin A ace

3、tate -COC15H31 维生素A棕榈酸酯,R :,（一） 为一个具有共轭多烯侧链的 环己烯,具有UV吸收最大吸收波长在325-328nm，随VA存在状态以及所用的溶剂，最大吸收波长的位置有所不同,存在多种立体异构化合物 天然VA侧链为全反式 天然来源主要是鱼肝油，为醋酸酯，棕榈酸酯等,目前多由人工合成。,1、结构特点,环己烯+共轭多烯侧链 cyclohexene with conjugated polyolefine side-chain,或有金属离子存在时氧化,不稳定性instability: light-catalysed cracking reactionredox reactio

4、n (oxidized by oxygen in air, or other oxidizing agents),（二）共轭多烯侧链 性质非常活泼. 易被氧化,baldheaded,环氧化epoxides,VitA醛epoxides,VitA酸,or,维生素A的氧化产物：,CHCl3,不溶于水insoluble in water 易溶于有机溶剂(乙醚，氯仿，异丙醇，环己烷，脂肪)和植物油等 soluble in ether, chloroform, isopropanol, cyclohexane,2 .性质 a. 紫外吸收 具有共轭多烯侧链紫外吸收。 最大吸收波长在325328nm，随VA存

5、在状态以及所用的溶剂，最大吸收波长的位置有所不同,VitA2dehydro-retinol,VitA3anhydro-retinol,C. 易发生脱氢、脱水、聚合反应,去氢维生素A,效价为维生素A1的40%，max345350nm,去水维生素A,效价低于维生素A1，max385390nm,侧连有4个双键应有 种异构体。目前，包括维生素A在内，共发现有6种异构体。它们是：,e. 维生素A异构体,d. 鲸醇维生素A醇的二聚体，没有生物活性,鲸醇,VA1 all-trans-retinolVA2 维生素A2 去氢维生素A dehydro- retinolVA3 维生素A3 去水维生素A anhydr

6、o-retinol,neo-vitamin A 2-,4-,2,4- cis-retinoliso- vitamin A异维生素Aa 6-,2,6-cis-retinol,新维生素Aa,新维生素Ab,新维生素Ac,异维生素Aa,异维生素Ab,维生素A,条件 无水无醇,CHCl3,Carr-Price反应 鉴别 含量测定,Reaction with SbCl3 carbonium ionin saturated chloroform solution, water, alcohol-free,Identification,蓝色,紫红,115维生素A的鉴别试验为 A. 三氯化铁反应 B. 硫酸锑反

7、应 C. 2,6-二氯靛酚反应 D. 三氯化锑反应 E. 间二硝基苯的碱性乙醇液反应,80. 下面哪些描述适用于维生素A BDA. 分子具有长二烯醇侧链，易被氧化B. 具有较长的全反式共轭多烯结构C.含酯键，经水解后产生苯并二氢吡喃衍生物，易被氧化D.与三氯化锑的无醇氯仿液中呈不稳定兰色，很快转变为紫红色 E.样品用无水乙醇溶解后，加硝酸加热后，呈橙红色,维生素A与 反应即显蓝色，渐变成紫红色；反应需在条件下进行。（ ） 维生素A分子中由于具有共轭多烯侧链，因而其性质很稳定，不易被氧化变质。,三氯化锑,无水无醇,（BP（1998）,max为326nm一个吸收峰,max为350390nm三个吸收

8、峰,VA的无水乙醇溶液在326nm有最大吸收。,VAmax: 326nm in anhydrous alcoholVA3max: 350390nm(348,367,389nm)in anhydrous alcohol,去水VitA（VitA3）,VitA,USP 显色剂 磷钼酸规定斑点颜色和Rf值,BP 杂质对照品法 显色剂 三氯化锑,确认醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯，例：VA和其标准品用环己烷溶解展开剂：环己烷乙醚（80：20）环己烷醋酸乙酯板：硅胶G显色：SbCl3T.S.Rf： VA 醇 0.08VA 醋酸酯 0.41VA棕榈酸酯 0.75,酸值,乙醇,置锥形瓶中,乙醚,酸值不得过2.0,

9、酚酞,5滴,15ml,15ml,氢氧化钠滴定液,0.1mol/L,至微显粉红色,供试品,2.0g,振摇使溶解,氢氧化钠滴定液,0.1mol/L,维生素A制备和储存过程中，酯化不完全或水解，均可生成醋酸。酸度大，也不利于维生素A的稳定，故应控制酸度。,滴定至紫蓝色消失，空白试验校正。消耗硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L) 不得过1.5ml。,碘化钾饱和溶液,1ml,水,硫代硫酸钠滴定液,0.01mol/L,过氧化值,供试品,1.0g,冰醋酸-氯仿(6:4),30ml,振摇使溶解,振摇,1分钟,100ml,淀粉指示液,1ml,维生素A结构中共轭双键，易被氧化成过氧化物，故应控制此类杂质。,立体

10、异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A（ VitA2） 去水维生素A（ VitA3）,UV法,（一）,紫外分光光度法三点校正法 Ultraviolet spectrophotometric method (three-point correction procedure, or three-wavelength correction procedure),维生素A具有共轭多烯醇侧链，有紫外吸收，可用于含量测定。但是，维生素A原料药中常混有多种杂质，包括其异构体、氧化降解产物（维生素A2、维生素A3、环氧化物、维生素A醛、维生素A酸等）、合成中间体、反应副产物等，这些杂质在维生素A

11、的最大吸收波长附近也有吸收，干扰维生素A的测定。为消除杂质干扰，中国药典采用三点校正法测定维生素A含量。,紫外分光光度法三点校正法,1.概述 共轭多烯的结构具有特征的紫外吸收。 相关物质结构相似,维生素A最大吸收波长附近也有吸收，对测定有影响。 Morton和Stubbs等人提出了三点校正法。,三点校正法 1. 条件： （1）杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； （2）物质对光的吸收具有加和性。,维生素A中的不相关吸收在310340nm范围内近似一条直线。,At = AVA+ Ai,Assuption (假设):I. the irrelevant abs

12、orption: is linear between 310340nm wavelenghs (at the three wavelenghs selected)II. the total absorbance of the mixture isthe sum of the individual absorbanceof components At = AVA+ Ai,2. 波长的选择： （1） 1 VitA的max（328nm） （2） 2 3 分别在1的两侧各选一点,测定对象 VitA醋酸酯,第一法 等波长差法这两个波长分别在1两侧12nm处，即,1=328nm; 2 =316nm; 3=

13、340nm,VA acetate: 1st method,5. 方法,Chp收载有2种方法。,第一法（适用于酯式维生素A的测定）,a. 操作方法,b. 计算方法,最大吸收波长确认max 在326329nm，第一法测定。max不在326329nm，第二法测定。,计算吸收度比及比值差,首先要计算吸收度比值 。,然后计算吸收度的比值差。,维生素A醋酸酯,IU/g供试品 = 供试品 1900,=,判断 是否在326329nm之间,在326329nm之间,改用第二法,是,否,求算并与规定值比较,规定值 差值,判断差值是否超过规定值的,有一个以上超过,无超过,计算 A328（校正）,用A328计算,Vit

14、AD胶丸中VitA的含量测定精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.08262g/丸）的内容物 0.2399g 至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为,A300 ：0.354 A316 ：0.561 A328 ：0.628 A340 ：0.523 A360 ：0.216,A300 /A328 ：0.555 A316/A328 ：0.907 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.811 A360

15、/A328 ：0.299,求本品中维生素A的含量？,A300 /A328 ：0.564 A316/A328 ：0.893 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.833 A360/A328 ：0.344,0.555 0.907 1.000 0.811 0.299,+ 0.01 0.010+ 0.02+ 0.04, ,= = = = =,第二法,第二法,计算校正吸收度,吸收度校正公式：,换算因数,定义：每一个 数值所相当的效价。,1IU=0.344g全反式维生素A醋酸酯， 1g的维生素A醋酸酯就相当于,维生素A醋酸酯,维生素A醋酸酯,练习题：维生素AD胶丸中维生素A的含量测定

16、 已知：平均胶丸重为0.0815g 维生素A的标示量为10000IU/丸 取样：,求：维生素A的标示百分含量。,测定数据如下表,维生素AD胶丸的测定：精密称取本品（标示量为每丸含维生素A为10000单位）装量差异项下的内容物0.1287g（每丸内容物的平均装量为0.07985g），置10 ml烧杯中，加环己烷溶解并定量转移至50 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2 ml，置另一个50 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以溶剂环己烷作空白，用分光光度法测定，测得最大吸收波长为328nm,再分别测定300 nm、316 nm、328 nm、340 nm、360 nm波长处的吸收度

17、见下表。试计算维生素A标示量的百分含量。,维生素A醇换算因数1830，维生素A醋酸酯换算因数1900， A325校正=6.815 A3252.555 A3104.260 A334， A328校正= 3.52（2A328A316A340）表 1 维生素AD胶丸分光光度法测定数据,首先要求样品的 。,根据比尔定律,A为测得吸收度or校正吸收度,首先计算吸收度比值和吸收度比值差。（填于上表）,由此可知，应该用测得的328nm处的吸收度计算。,然后计算校正吸收度与未校正吸收度相差的百分数,由结果知，需计算校正吸收度。,所以,维生素A的标示含量,这样,第二法 等吸收度法(皂化法、6/7A法 ) VA在这

18、两个波长下的吸光度应该等于1下的吸光度的,1=325nm; 2 =310nm; 3=334nm,6/7,消除植物油干扰：适用于维生素A醇;第一法无法消除杂质干扰时用此法,在300，310，325和334nm处测定吸收度，找出max,水溶性,脂溶性,3.测定法,（1）基本步骤: 第一步 A选择 选择依据： 所选A值中杂质的干扰已基本消除 第二步 求注意：C 为混合样品的浓度,第三步 求效价,换算因数由纯品计算而得：,第四步：求标示量,=,IU/g供试品 = 供试品 1830,水溶性,脂溶性,判断max是否在323327nm之间,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算,是,否,判断 A300 /

19、A325 是否大于0.73,是,否,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算A325(校正),0,3%,3%,77中国药典（2005年版）规定维生素A的含量测定采用紫外分光光度法 （三点校正法），此法又分为A等波长差法 B等吸收度法 C6/7 A法 D差示分光法 E双波长法,5、注意事项（1）VA遇光易氧化变质，操作应半暗室中快速进行，所用试剂不得含氧化性物质，以防VA紫外线或氧化性物质破坏。（2）用三校正法测定时，一点在max处，其余两点均为吸收曲线的上升和下降陡坡处。对波长的正确性要求严格。340nm处，若波长误差0.5nm，可影响结果-3.12.07%。所以测定时所用仪器的波长读数应注意

20、，必要时应作标准。,维生素A醋酸酯胶丸含量测定:取内容物39.1 mg,加环己烷溶解 并稀释成100ml，在下列五个波长处测得吸收度A值如下：,已知：平均胶丸内容物重为0.08736g;维生素A的标示量为 3000 IU/丸 试求：维生素A的标示百分含量？,维生素A醋酸酯胶丸的含量测定，取内容物W，加环己烷溶解并稀释至10ml，摇匀，精密量取0.1ml,再加环己烷稀释至10ml ，使其浓度为915IU/ml。已知内容物平均重量为80.0mg,每丸标示量为10000IU。试计算取样量（ W ）的范围是多少？,So: z(A2 v Acorr.) = (y+z)(A1 Acorr.) y(A3 w

21、Acorr.)For alcoholv=w=r=6/7; y=15, z=9(nm)A325corr.=7A3254.375A3342.625A310(97.36%),For acetatev=0.907, w=0.811; y=z=12A328corr.=1/0.282(2A328A316A340)(97.26%)=3.54(2A328A316A340),第二法,第二法,VitAD胶丸中VitA的含量测定精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.08262g/丸）的内容物 0.2399g 至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一2

22、0 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为,A300 ：0.354 A316 ：0.561 A328 ：0.628 A340 ：0.523 A360 ：0.216,A300 /A328 ：0.555 A316/A328 ：0.907 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.811 A360/A328 ：0.299,求本品中维生素A的含量？,A300 /A328 ：0.564 A316/A328 ：0.893 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.833 A360/A328 ：0.3

23、44,0.555 0.907 1.000 0.811 0.299,+ 0.01 0.010+ 0.02+ 0.04, ,= = = = =,三氯化锑比色法,（二）,优点 简便 快速,max 618nm620nm,标准曲线法,苯骈二氢吡喃醇（色满醇）,ch10-2-2 维生素E,Structure-Tocopheryl acetate(other: -, -, -)ChP2000: dl- -Tocopheryl acetatenatural productd- -Tocopherol(14%)synthetic productdl- -Tocopherol,*,*,*,1,4,5,8,名称：消

24、旋生育酚醋酸酯 母核：苯骈二氢吡喃衍生物苯环上有一乙酰化的酚羟基 侧链：脂肪烷烃,生物效价右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10,（天然品）,（合成品）,dl生育酚醋酸酯,结构与性质,一、,苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链,1、易溶于有机溶剂，不溶于水,2、UV,3、酯键 易水解,溶解性,还原性,水解性,紫外吸收,二、鉴别,（一）硝酸反应,橙红色,nitric acid reaction(redox reaction),本品约30mg，加无水乙醇10ml溶解后，加硝酸，75加热约15分钟，显橙红色。VE + HNO3 orange-red(tocopherol-red)o-quinonoid

25、 form(邻醌),（橙红色）,生育红,生育酚,HNO3,强氧化剂,维生素E-鉴别,供试品,适量,振摇,溶解,无水乙醇,滤液在充氮情况下渐渐加热蒸去乙醚，残液,2ml,溶液显橙红色,硝酸反应,50ml,乙醇,200ml,两次提取，合并提取液,无水硫酸钠,滤过,无水乙醇,10ml,溶解,硝酸,摇匀,75加热,15分钟,取本品约30mg，加无水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在75加热15分钟，溶液应显橙红色。,三氯化铁联吡啶反应,（二）,本品，在碱性条件下水解， 得生育酚，在联吡啶和三氯 化铁试液的作用下，反应产生血 红色配离子。,水解后氧化反应 redox reaction after

26、 hydrolysis：,VE + KOH free tocopherol,生育酚,对-生育醌,弱氧化剂,红色,free tocopherol+Fe3+ p-tocopherquinone +Fe2+p-quinonoid form(对醌)Fe2+ + 2,2-bipyridyl (联吡啶) blood-redpyridine ferroprotoporphyrin (吡啶亚铁红素),三氯化铁联吡啶反应,维生素E-鉴别,供试品,约10mg,放冷,振摇，静置使分层,显血红色,三氯化铁-联吡啶反应,煮沸,5分钟,取乙醚液,2ml,乙醇制氢氧化钾试液,2ml,4ml,水,10ml,乙醚,2,2-联吡

27、啶乙醇液(0.5100),数滴,三氯化铁的乙醇溶液(0.2100),数滴,= 41.045.5,max = 284nm,min = 254nm,0.01%无水乙醇中,维生素EUV图,鉴别维生素E可采用的反应有,A.三氯化铁反应 B.硫色素反应 C.醋酐浓硫酸反应 D.硝酸反应 E.盐酸反应,薄层板 硅胶G,展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）,显色剂 硫酸（105 5）,VitE Rf = 0.7,中国药典（2005年版）新增IR法鉴别VE 供试品的红外吸收谱图与对照谱图比较应一致,三、检查检游离生育酚查,铈量法,利用游离生育酚的还原性， 将硫酸铈还原成硫酸亚铈,（二）,试剂,硫酸铈滴定液（0.

28、01mol/L） 二苯胺（亮黄灰紫）,滴定，消耗滴定液不得过1.0ml,二苯胺试液,1滴,硫酸铈滴定液,0.01mol/L,供试品,0.10g,无水乙醇,5ml,溶解,维生素E-检查,生育酚,维生素E中未酯化的游离生育酚是一种特殊杂 质，其检查原理是利用游离生育酚具有还原性， 可被硫酸铈定量氧化，以此控制游离生育酚限量。,取0.1g样品，按铈量法用Ce(SO4)2(0.01mol/L)滴定，以二苯胺为指示剂，消耗Ce(SO4)2液不得超过1.0ml。,Test of free tocopherol,（M生育酚= 430.8）,例,取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫

29、酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过 1.0ml。,2.15,药典规定,消耗硫酸铈液（0.01mol/L）1.0ml,设：应消耗硫酸铈液 V ml,0.011.0 实际浓度 V,若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L，应重新计算硫酸铈的消耗量,例 Ce(SO4)2 = 0.01020mol/L,维生素E-检查,酸度,乙醇,置锥形瓶中,乙醚,不得过0.5ml,酚酞,15ml,15ml,氢氧化钠滴定液,0.1mol/L,至微显粉红色,供试品,1.0g,溶解,氢氧化钠滴定液,0.1mol/L,0.5ml,取本品适量，精密称定，加二甲基甲酰胺溶解并定量稀释制成

30、约50mg/ml，作为供试品溶液。另取正己烷适量，加二甲基甲酰胺定量稀释制成约10g/ml，作为对照品溶液。照残留溶剂测定法(第一法)测定，以HP-5毛细管柱(5聚甲基硅氧烷)为分析柱，氮气为载气，用氢火焰离子化检测器，柱温50保持8分钟，然后以每分钟45升至260，保持15分钟，含正己烷应符合规定(天然型)。,维生素E-检查,正己烷,GC法,（一）,GC特点,1、,选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好,挥发性低、不稳定、极性强衍生化易受样品蒸气压限制,以硅酮(OV-17)为固定相，涂布浓度为2，或以HP-1毛细管柱(100二甲基聚硅氧烷)为分析柱；柱温265。理论板数按维生素E峰计算不低于

31、500(填充柱)或5000(毛细管柱)，维生素E峰与内标物质峰的分离度应符合要求。,2、色谱条件及系统适应性试验,内标法加校正因子,1、色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：2m4mmI.D.硼硅玻璃柱， 担体硅藻土（80100目）或高分子多孔小球 固定相：硅酮（OV-17） 涂布浓度 2%或以HP-1毛细管柱(100二甲基聚硅氧烷)为分析柱； 载气N2 流速:含2%固定相：以1820分钟为宜； 含5%固定相：以3032分钟为宜 柱温：265 内标：正三十二烷 检测器氢火焰离子化检测器(FID) 性能要求： n 500；理论塔板数按VE峰计算应不低于500，或5000(毛细管柱)R2；VE峰与内标

32、物质峰的分离度应大于2。,2、溶液配制： 内标溶液：正三十二烷的环己烷溶液 （1.0mg/ml） 对照溶液：对照品溶解于内标溶液中 (1mg/ml) 供试品溶液：供试品约50mg，用内标溶液，溶解并稀释至50ml,4、供试品测定mg=FAxMs/AsAx ：供试品峰面积F：校正因子As ： 内标物的峰面积 5、特点：（1）简便快速、专属性强，适用于VE、VE制剂及多种维生素制剂中VE的测定。（2）需要特殊仪器,内标法,供试液（样品+内标）,内标物,对照液（对照+内标）,校正因子：,实际工作中的计算方法,例,内标液 取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成1.0mg/ml溶液,对照液 精密称取VitE对

33、照品0.2011mg 置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取13ul注入GC仪，测定，计算,供试液 精密称取供试品0.1998g置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取13ul注入GC仪，测定，计算,对照液,供试液,本品含C31H52O3应为96.0 102.0%,BP GC 内标 正三十二烷R1.4,USP GC 内标 十六酸十六醇酯R1.0,JP HPLC 外标 dl生育酚R1.4,（二）铈量法,1、原理 利用生育酚的易氧化性,VE用硫酸加热回流，水解成生育酚，用硫酸铈定量地氧化为对一生育醌，过量的硫酸铈氧化二苯胺指示剂而指示滴定终点。,2

34、、指示剂,二苯胺（亮黄灰紫）,还原型,氧化型,2、反应条件 （1）VE在H2SO4酸性条件下水解为宜。碱性溶液中游离生育酚易被氧化。Ce(SO4)2液滴定在酸性溶液中进行,如在碱性中会生成碱式盐而影响测定。 （2）Ce(SO4)2溶于酸水溶液，不溶于醇,生育酚溶于酸而不溶于水, 滴定过程中应有一定浓度的乙醇。 （3）本法适用于纯度高的VE供试品。,防止Ce(SO4)2的水解 减慢生育酚被O2氧化速度,C、酸性条件,Ce(SO4)2易溶于水 生育酚易溶于醇,B、溶剂,分子量较大，反应慢 易被O2氧化,A、反应速度,VE在H2SO4酸性条件下水解为宜。 碱性溶液中游离生育酚易被氧化。Ce(SO4)

35、2液滴定在酸性溶液中进行,如在碱性中会生成碱式盐而影响测定。,Ce(SO4)2溶于酸水溶液，不溶于醇,生育酚溶于酸而不溶于水,滴定过程中应有一定浓度的乙醇。,MVitE = 472,样品 dl生育酚 固定相十八烷基硅烷键合硅胶ODS 流动相甲醇-水（49 ：1） 检测波长292nmR2.6RSD0.8%,对照品法定量,测定对象血清中VitA和VitE 固定相十八烷基硅烷键合硅胶 流动相甲醇-水（96 ：4） 检测波长 8前330nm8后292nm,维生素D,维生素D2,一、结构与性质,维生素D3,开环的甾体：具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。,手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。,多烯：可

36、进行紫外检测。,二、鉴别试验,1. 显色反应,三氯化锑反应 橙红色渐变粉红,三氯化铁反应 橙黄色,二氯丙醇和乙酰氯反应 绿色,2. 比旋度鉴别,维生素D2,维生素D3,溶 剂,浓 度,比旋度值,无水乙醇,无水乙醇,40mg/ml,5mg/ml,+102.5+107.5,+105+112,注意事项：应于容器开启30分钟内取样，在溶液配制后30分钟内测定。,3.区别反应：以96%乙醇为溶剂，加乙醇和85%硫酸，D2 显红色，在570nm处有最大吸收，D3显黄色， 在495nm处有最大吸收。,4.其他方法：TLC、HPLC、制备衍生物测熔点,三、杂质检查,维生素D2中麦角甾醇的检查：加洋地黄皂苷溶液

37、，混合，放置18h不得发生浑浊或沉淀。,前维生素D的光照产物,四、含量测定方法,中国药典（2000年版）采用正相高效液相色谱法测定维生素D的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯，该法分为三个方法。 固定相：硅胶 流动相：正己烷-正戊醇（997：3）,第一法：用于无维生素A醇及其它杂质的干扰的情况，步骤如下： 1系统适用性试验：测定重复性和分离度。,2测定校正因子：A S /m S f1 = - A r /m r f2 =（A S m r- f1 m S A r1）/（A r1 m S）,3含量测定： mi=（f1 Ai1+ f 2 A i2）m S /A S,第二法：用于有杂质的干

38、扰的情况，步骤如下： 1皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙醚、制备供试液A。 2净化：供试液A经液相色谱分离，准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，制 备成供试液B。 固定相：ODS 流动相：甲醇-乙腈-水（50：50：2） 3含量测定：取供试液B按第一法测定。,第三法：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况。步骤如下： 1制备供试液：取供试液A，净化，水浴加热，得供 试液C。 制备对照液：对照品储备液：稀释、加热。 2含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样对照液和供试液，按外标法定量。,氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱),HCl,Cl-,2-1维生素B1的分析,氯

39、化3-（4-氨基-2-甲基嘧啶-5-）甲基-5-（2-羟乙基）-4-甲基噻唑的盐酸盐,一、化学结构与性质 1.结构：,亚甲基,结构特点： a.氨基嘧啶次甲基噻唑环季铵化合物 b.碱性基团：嘧啶环上的氨基 可与酸成盐噻唑环上的季铵 如：盐酸硫胺、硝酸硫胺,（一）,溶解性,1、易溶于水，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。,2、水溶液呈酸性,（二）,UV,共轭双键,max = 246nm,（三）,硫色素反应,thiochrome reaction ChP,噻唑环,还原性,VB1噻唑环在碱性条件下可被铁氰化钾K3Fe(CN)6等一些氧化剂氧化后，与嘧啶环上的氨基缩合成具有荧光的硫色素。,VB1专属反应，,鉴

40、别、含量测定,嘧啶环 伯氨,噻唑环 季铵,1、可与酸成盐,2、与生物碱,3、含量测定 非水碱量法,（四）,碱性,重量法,硅钨酸,(五) 加碱分解后与醋酸铅反应VB1与NaOH试液一起加热，分解产生NaS，可与PbAc2反应生成PbS的黑色沉淀。(六)维生素B1的水溶液显氯化物的特征反应。,Identification,（一）硫色素反应thiochrome reaction,VB1专属反应，用于鉴别和含量测定。,ChP,硫色素,2H,VitB1,H+,H+,H+,H+,碘化汞钾,碘,可与某些生物碱沉淀试剂 生成组成恒定的沉淀,苦味酸,重量法测定VB1含量,（三）硫胺显碱性 具有两个碱性基团:噻唑

41、环上的季铵嘧啶环上的氨基 可以和酸成盐。 如：盐酸硫胺、硝酸硫胺。,S元素反应,Cl-反应,加碱分解后与醋酸铅反应:VB1与NaOH试液一起加热，分解产生NaS，可与PbAc2反应生成PbS的黑色沉淀。,维生素B1的水溶液显 氯化物的特征反应。,H+,三. 含量测定 非水滴定法（ChP原料药所用方法） 硅钨酸重量法 银量法 硫色素荧光法 紫外分光光度法（ChP制剂所用方法） 酸性染料比色法 配位滴定法,喹那啶红亚甲蓝（紫红天蓝）,VB1分子中含有已成盐的伯胺和季铵基 团，在非水溶液中，在醋酸汞存在下，均 可被高氯酸滴定。,2、方法：溶剂：冰醋酸 指示剂：喹哪定红- 亚甲蓝混合指示液 滴定剂：高

42、氯酸 醋酸汞： 终点：天蓝色 空白校正： T=16.86mg/ml,UV法,（二）,片剂、注射剂,= 421,（每片）相当于标示量的%=,A = ECL,规格 g/片,g/100ml,g,ChP,（每ml）相当于标示量的%=,规格 g/ml,ml,准确度高 灵敏度低 操作繁琐 设备简单,（1）比较准确、灵敏；（2）方法简便，不需要特殊仪器；（3）恒重比较费时间。,Silicotungstic acid gravimetric method,（三）硅钨酸重量法,VB1在酸性溶液中与硅钨酸作用 产生沉淀，根据沉淀的重量和供试品 的重量即可计算其含量。,2337.27,3479.22,2VB1硅钨酸

43、,白色沉淀4HCl,（含义：1g沉淀相当于0.1939gVB1）,取本品约50mg，精密称定，加水50ml溶解后，加盐酸2ml，煮沸，立即滴加硅钨酸试液4ml，继续煮沸2分钟，用80恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液（120）20ml分次洗涤，再用水10ml洗涤1次，最后用丙酮洗涤2次，每次5ml，在80干燥至恒重，精密称定，所得重量与0.1939相乘，即得,例,精密称取本品0.0519g，加水50ml溶解，加盐酸2ml煮沸，立即滴加 硅钨酸试液4 ml，继续煮沸2分钟，用 80恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀 先用煮沸的盐酸溶液（120）20 ml 分次洗涤，再用水10ml 洗涤1次

44、，后 用丙酮洗涤2次，每次5ml。在80干 燥至恒重，称得沉淀重量为0.2557g。 求本品的含量按干燥品计算为多少？,(本品干燥失重项下测定结果为3.73%),4、实验条件 （1）取样量：应在50mg左右，不得少于25mg。提高灵敏度 （2）加入盐酸的目的：增大沉淀颗粒， 易于过滤。酸量不足：沉淀的颗粒过细。 酸量过多：无太大影响。 （3）硅钨酸的用量：硅钨酸：VB1= 8：1；使沉淀完全用量不足，导致结果偏低,（4）干燥温度：80，干燥3hr，至恒重，保持沉淀含4分子结晶水，换算因数为0.1939 （5）硅钨酸的加入速度用滴管一滴一滴加入硅钨酸边搅拌边缓慢加入，增大沉淀颗粒；纯度高快加，纯

45、度低慢加。防止沉淀表面吸附的杂质来不及离开而被沉淀包围。,（6）煮沸时间25min为宜使沉淀颗粒大，利于过滤洗涤。 （7）沉淀的洗涤用热稀盐酸洗涤，洗涤液用量不得多于50ml，否则，沉淀会部分溶解 （8）洗器用4号垂熔玻璃漏斗为宜。,4、重量法特点（1）比较准确、灵敏；（2）方法简便，不需要特殊仪器；（3）恒重比较费时间。,（四）硫色素荧光法,1、原理,NaOH,2、方法与计算,激发波长365nm 发射波长435nm,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇,S,d,A,b,对照液,供试液,（1）灵敏度高

46、，线性范围宽 （2）代谢产物不干扰，适用于体液分析,例:维生素B6 发生蓝靛酚反应，是因为其分子具有,A.C3位羟基使对位氢较活泼 B.C3位羟基上的氢较活泼 C.甲基 D.吡啶环 E.盐酸,维生素C(L-Ascorbic acid),维生素C分子中具有2个手性C原子，具有4种光学异构体。其中生理活性最强的是L（+）-抗坏血酸,D(-)-异抗坏血酸,L(+)-异抗坏血酸,L(+)-抗坏血酸,D(-)-抗坏血酸,一、结构与性质,（一）溶解性,1.易溶于水,2.水溶液呈酸性,烯二醇结构酸性。C3-OH， pKa=4.17(共轭效应)C2-OH，pKa=11.57(邻位羰基)一元酸。能与NaHCO3

47、作用生成钠盐。,3.具有内酯结构。碱性下可水解。,二烯醇结构,二酮基结构,二烯醇结构,具有烯二醇基， 还原性，能够被氧化成去氢抗坏血酸。 酸性,能与碱成盐。,有活性,有活性,无活性,糖类的显色反应,50,结构与糖类相似,C3OH的 pKa = 4.17 (共轭效应),C2OH的 pKa = 11.57 (邻位羰基),一元酸,烯二醇结构,能与NaHCO3作用生成钠盐。,抗坏血酸,L(+)抗坏血酸 活性最强,手性C（C4、C5）,*,*,有活性,有活性,无活性,（六） 水解反应具有内酯结构。 碱性下可水解。,L-二酮古罗糖酸 (无生物活性),与碱反应,L-二酮古罗糖酸 (无生物活性),维生素C常采用的鉴别试验有,A.硝酸银反应 B.硫色素反应 C.2，6二氯靛酚钠反应 D.碱性酒石酸铜反应 E.红外吸收光谱法,1、与AgNO3反应,2、与2，6 - 二氯靛酚反应,(ChP2005),氧化型,玫瑰红色,(ChP2005),2.还原性 烯二醇基还原性。如：,