1、ICS 67.050B 31 DB12天 津 市 地 方 标 准DB12/T 6472016大 白 菜 品 种 纯 度 SSR 分 子 标 记 检 测 方 法Methods of identifying varietal purity of Chinese cabbage by using SSR-based markers2016-09-27 发布 2016-11-01 实施天 津 市 市 场 和 质 量 监 督 管 理 委 员 会 发 布DB12/T 6472016I前 言本 标 准 按 照 GB/T 1.12009 给 出 的 规 则 起 草 。 本 标 准 由 天 津 市 农 村 工
2、作 委 员 会 提 出 。 本 标 准 起 草 单 位 ： 天 津 市 农 业 质 量 标 准 与 检 测 技 术 研 究 所 、 天 津 市 蔬 菜 研 究 中 心 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 赵 新 、 王 超 楠 、 兰 青 阔 、 王 成 、 刘 莉 莉 、 朱 珠 、 李 梅 、 陈 锐 、 徐 石 勇 。 本 标 准 2016 年 9 月 首 次 发 布 。DB12/T 64720161大白菜品种纯度 SSR 分子标记检测方法1 范围本 标 准 规 定 了 大 白 菜 品 种 纯 度 SSR分 子 标 记 检 测 方 法 的 术 语 和 定 义 、 检 测 方 法 、 纯
3、 度 计 算 方 法 。 本 标 准 适 用 于 大 白 菜 单 交 种 的 纯 度 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB/T 3543.2 农 作 物 种 子 检 验 规 程 扦样GB/T 6682 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法3 术 语 和 定 义
4、下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1品 种 纯 度 varieties purity品 种 纯 度 指 种 子 在 SSR分 子 标 记 带 型 方 面 典 型 一 致 的 程 度 ， 用 具 有 本 品 种 特 异 带 型 的 种 子 粒 数 占 检 测 样 品 种 子 粒 数 的 百 分 率 表 示 ， 以 反 映 某 品 种 特 征 特 性 的 一 致 性 程 度 。3.2聚 合 酶 链 式 反 应 polymerase chain reaction（ PCR）一 种 在 体 外 通 过 酶 促 反 应 扩 增 特 异 DNA片 段 的 技 术 。3.3简 单 重
5、 复 序 列 simple sequence repeat（ SSR）由几个核苷酸（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100-200bp ）的串 联 重 复 序 列 ， 又 称 微 卫 星 序 列 或 短 串 联 重 复 序 列 ， 其 高 度 多 态 性 主 要 来 源 于 串 联 数 目 的 不 同 。3.4分 子 标 记 molecular marker以 蛋 白 质 、 核 酸 分 子 的 多 态 性 为 基 础 ， 检 测 生 物 在 遗 传 上 的 差 异 。4 原理SSR分布 于 大 白 菜 整个 基 因组 ， 每 个位 点上 重复 单位 的数目 不同
6、造成 了品 种间 的多态 性 ， 利 用 PCR技 术 将 多 态 的 SSR扩 增 出 来 ， 通 过 电 泳 检 测 扩 增 产 物 ， 利 用 电 泳 图 谱 进 行 大 白 菜 品 种 纯 度 检 测 。DB12/T 647201625 仪 器 设 备 及 试 剂5.1 仪 器 设 备PCR仪 ； 测 序 电 泳 槽 ； 水 平 电 泳 槽 ； 高 压 电 泳 仪 （ 3000 V， 400 mA， 400 W） ； 万 分 之 一 电 子 天 平 ； 微 量 加 样 器 ； 磁 力 搅 拌 器 ； 台 式 离 心 机 ； 紫 外 -可 见 成 像 系 统 ； 胶 片 观 察 灯 ；
7、水 平 摇 床 ； 高 压 灭 菌 锅 ； pH计 等 。5.2 试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na 2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基 硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl ）；氢氧化钠（NaOH ）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青 FF； 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 ； 丙 烯 酰 胺 ； 尿 素 ； 亲 和 硅 烷 ； 剥 离 硅 烷 ； 无 水 乙 醇 ； 四 甲 基 乙 二 胺 （ TEMED） ； 过 硫 酸 铵 ； 冰 醋 酸 ； 硝 酸 银 ； 甲 醛 溶 液 （ 37%） ； Taq DNA聚 合 酶 （ 含 Mg2+的 10PCR缓
8、冲 液 ） ； 四 种 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 （ dNTPs） ； SSR引 物 ； 琼 脂 糖 ； Gold View染 料 ； 实 验 用 水 为 重 蒸 馏 水 或 符 合 GB/T 6682规 定 的 一 级 水 等 。 除 特 殊 说 明 外 ， 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯 试 剂 。5.3 溶 液 配 制相 关 溶 液 配 制 方 法 见 附 录 A。6 方 法 步 骤6.1 取样按 照 GB/T 3543.2规 定 方 法 扦 样 ， 从 送 检 样 品 中 随 机 取 10 g种 子 ， 分 别 随 机 取 其 亲 本 种 子 10粒 。6.2 单 粒 种 子 的
9、 DNA 提取6.2.1 样 品 预 处 理在 玻 璃 培 养 皿 底 部 垫 上 一 层 厚 度 适 宜 的 棉 花 ， 用 自 来 水 浸 湿 后 均 匀 地 撒 上 种 子 ， 再 于 表 面 覆 盖 一 层纱布 ， 置 于光 照培 养箱 中。 培 养条 件为 16小 时35 光照 培养 ， 8小时2 8 暗 培养， 待种 子长 出 子 叶后 备 用 。 也 可 采 用 经 验 证 的 、 等 效 的 培 养 条 件 。6.2.2 DNA 提 取取 单 株 幼 苗 子 叶 ， 放 入 1.5 mL离 心 管 中 ， 在 液 氮 中 研 碎 ， 放 入 1.5 mL离 心 管 中 。 将
10、DNA提 取 液 预 热到65 ， 每 管 放 入 400 L混 合 样 品 ， 将 离 心 管 置 于 65 金 属 浴 或 水 浴 锅 中 ， 保 温 30 min后 取 下 ， 向 离 心 管 中 加 入 400 L 24:1氯 仿 -异 戊 醇 （ V:V） ， 振 荡 混 匀 。 10 000 g离 心 10 min。 将 上 清 液 200 L转 入 另 一 支 1.5 mL离 心 管 ， 加 入 400 L -20 预 冷 无 水 乙 醇 沉 淀 DNA。 10 000 g离 心 1 min， 弃 上 清 液 ， 加 入500 L乙 醇 乙 酸 铵 溶 液 ， 6000 g离 心
11、 5 min收 集 沉 淀 。 加 入 100 L TE（ pH8.0） 溶 液 溶 解 DNA。 用 0.8 %的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 DNA。 使 用 紫 外 -可 见 成 像 系 统 观 察 DNA电 泳 条 带 的 完 整 性 。6.3 分 子 标 记 筛 选用 30对 核心 引物 进行 PCR反应 ， 扩 增双 亲及 送检 样 品各 10份 DNA， 筛 选带 型 清晰 ， 双 亲间 差异 大， 互 补 性 好 的 引 物 作 为 纯 度 检 测 的 SSR分 子 标 记 。6.4 PCR 扩 增3DB12/T 64720166.4.1 反 应 体 系总 体 积 20
12、 L， 包 括 9.2 L超 纯 水 、 2 L含 Mg2+的 10PCR缓 冲 液 、 1.6 L dNTPs（ 2.5 mmol/L） 、 3.2 L SSR引 物 （ 10 mol/L） 、 2 L Taq DNA聚 合 酶 （ 2.5 U/L） 、 2 L DNA（ 3050 ng/L） ， 混 匀 。6.4.2 反 应 程 序94 预变 性 5 min； 94 变性 1 min， 58 退 火45 s ， 72 延 伸45 s ， 循环 35次 ； 72 延 伸7 m in；-20 保 存 备 用 。6.5 变 性 聚 丙 烯 酰 氨 凝 胶 电 泳按 照 附 录 C规 定 的 方
13、法 ， 进 行 4.5%变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 制 作 及 电 泳 检 测 扩 增 产 物 。7 纯 度 计 算以筛选出 来的 SSR分子标 记为引 物 扩增 送检样 品的 DNA，通过 带型统 计， 用 具有本品 种特 异带型 的 种 子 粒 数 占 检 测 样 品 种 子 粒 数 的 百 分 率 表 示 纯 度 ， 计 算 公 式 如 下 ：. 纯 度 % 具 有 本 品 种 特 异 带 型 的 种 子 粒 数 检 测 样 品 种 子 粒 数 100%4DB12/T 6472016附 录 A（ 规 范 性 附 录 ） 溶 液 配 制A.1 DNA提 取 液含 有 200 mmo
14、l/L Tris-HCl（ pH 8.0） ， 250 mmol/L NaCl， 25 mmol/L EDTA， 0.5%SDS， 经 高 压 蒸 汽 灭 菌 后 使 用 。A.2 引 物 稀 释按 照 引 物 合 成 单 的 说 明 先 配 制 100 mol/L的 储 存 液 ， 取 适 量 储 存 液 稀 释 40倍 ， 配 制 浓 度 为 2.5 mmol/L的 使 用 液 。A.3 6变 性 上 样 缓 冲 液去 离 子 甲 酰 胺 49 mL， 0.5 mol/L的 EDTA溶 液 （ pH 8.0） 1mL， 溴 酚 蓝 0.125 g， 二 甲 苯 青 0.125 g。A.4
15、10电 泳 缓 冲 液Tris 108g， 硼 酸 55 g， 0.5 mol/L EDTA（ pH 8.0） 溶 液 37 mL， 定 容 至 1000 mL。A.5 40%丙 烯 胺 胶丙 烯 酰 胺 190 g， 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 10 g， 定 容 至 500 mL。A.6 4.5%丙 烯 胺 胶尿 素 450 g， 10电 泳 缓 冲 液 100 mL， 40%丙 烯 酰 胺 胶 112.5 mL， 定 容 至 1000 mL。A.7 1%亲 和 硅 烷20 L亲 和 硅 烷 ， 20 L冰 醋 酸 ， 加 无 水 乙 醇 至 2 mL。 现 用 现 配 。A.8 2%剥
16、离 硅 烷1 mL剥 离 硅 烷 ， 49 mL三 氯 甲 烷 。A.9 10%过 硫 酸 铵0.1 g过 硫 酸 铵 溶 于 1 mL超 纯 水 中 。 现 用 现 配 。A.10 固定液5DB12/T 6472016200 mL冰 醋 酸 ， 定 容 至 2000 mL。A.11 染色液4 g硝 酸 银 ， 定 容 至 2000 mL。A.12 显影液2000 mL蒸 馏 水 中 加 入 40 g氢 氧 化 钠 和 10 mL甲 醛 。6DB12/T 6472016附 录 B（ 规 范 性 附 录 ） 30 对 核 心 引 物序号 名称 序列（5-3 ）01 BC-1 F: TTTGTCC
17、CTATTGCTCAGGG R: CCGAGAACGTCTTCTCCTTG02 BC-2 F: TGGGGATGTGAGCTTCTTCT R: AGAGAGGAGAGAAAGGGCCA03 BC-3 F: CTTCCACAGGAGGAGACTGC R: TCTCTGCAAAGACCAACGTG04 BC-4 F: TGGACAACACATTGCACAGA R: ATGTCTGGCTTCATTCACCC05 BC-5 F: CAAGAGTCCAAAAGCCGAAC R: CCTTGCTTGCATCAGTTTCA06 BC-6 F: GGCAAAAGAAGAGGAACCAA R: CAGAGCCA
18、TCCCATTCAAGT07 BC-7 F: TGTACATGCGTGTCAAGGGT R: TGCGGTTTGAGCAGTAGTTG08 BC-8 F: AACGGATCTGACTTGGCATC R: TTCCTAAGGGAACGGTGAAA09 BC-9 F: ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT R: TTTTGAACGAGGTGGAGGAC10 BC-10 F: GAATCCTTTGGAAACGACGA R: GGGGACACAATTCTCCTGAA11 BC-11 F: CAGGCTTAGGAAGCAGGATG R: TTGCAACATGCCAAAACATT12 BC-12 F:
19、 TCCCTCGTGACAAATCTCAA R: TGAGATGCCGTTGACTTCAG13 BC-13 F: CAAAACTGATTGAAACCCACC R: GCTTGGAACACTATCCCGAA14 BC-14 F: AAACAAACCTCCCCATCTCC R: AACGGATCTGACTTGGCATC15 BC-15 F: CCCCTAATTCTCAAACGCAA R: TGACGATGTATCAAACGACCT16 BC-16 F: CTTGCAAATGACCTGCTTGA R: GGGAGTTGGAGATGAGGTGA17 BC-17 F: AAAGACCAACCGTGAAC
20、GAG R: TTCAGCAATACCTTCCCCAG7DB12/T 6472016序号 名称 序列（5-3 ）18 BC-18 F: CACTAGGTCCACCGTCAGGT R: CATCTTCCCCCATGTTCATC19 BC-19 F: TTGAAACTTGGTTGACGACG R: TTCTTCTTTGCGGCTGATTT20 BC-20 F: CCACCATCGCTTCTCAGATT R: GTCTCGTCAGGCCTCTTTTG21 BC-21 F: GATGCTGCTGACACCAAAGA R: CAGATTTGCTGAAACCCAAG22 BC-22 F: AAACAAAC
21、CTCCCCATCTCC R: AACGGATCTGACTTGGCATC23 BC-23 F: TCGGAGATTATCGGAAGTGG R: TCAGAAACCCTGAGAATCCG24 BC-24 F: AGCTCGTTTCTGTTCGGAGA R: GCCAACGAAGGAGTCAAAAG25 BC-25 F: AACGGATCTGACTTGGCATC R: AAGGGAACGGTGAAAATGAG26 BC-26 F: ATAACAACAACCTGCCCGAG R: GAAGCACAAGAACAGGGCTC27 BC-27 F: ATCCAAAAGGAAGAATCCCG R: AAAC
22、GAGAATTTTCCTGCGA28 BC-28 F: TAACTTCTCCCCCGTCCTCT R: GAGATGGCTACAGTGGCTCC29 BC-29 F: AAGAAGAGAGGAAGGCCGAG R: ACCCACATAGCATGAGAGCC30 BC-30 F: AAACAAACCTCCCCATCTCC R: AACGGATCTGACTTGGCATC8DB12/T 6472016（ 规 范 性 附 录 ） 制 胶 过 程C.1 凝 胶 制 作将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。在长板上涂1%亲和硅烷，在短板上涂2% 玻璃硅烷。 操 作 过 程 中 防 止 两 块 玻 璃 板
23、互 相 污 染 。 待 玻 璃 板 彻 底 干 燥 后 ， 将 其 组 装 好 ， 用 水 平 仪 调 平 。 取 4.5%丙 烯酰胺 胶 80 mL， 加入T EMED 80 L和10% 过 硫酸 铵 400 L， 迅速混 匀后 灌胶 。 灌胶过 程中 防止 气泡 产 生 。 灌 胶 结 束 后 ， 将 梳 子 齿 向 外 ， 轻 轻 的 插 入 胶 中 ， 使 其 聚 合 1 h以 上 。C.2 预电泳待 胶 凝 固 后 ， 拔 出 梳 子 ， 将 电 泳 槽 组 装 好 ， 80 W恒 功 率 下 预 电 泳 15 min20 min。C.3 变性在 20 L PCR产 物 中 加 入
24、4 L 6变 性 上 样 缓 冲 液 ， 混 匀 后 ， 在 PCR仪 上 运 行 变 性 程 序 ： 95 变 性5 m in， 4 冷 却 10 min。C.4 电泳用 洗 耳 球 吹 洗 加 样 槽 ， 清 除 气 泡 和 杂 质 。 每 个 加 样 孔 加 入 5 L变 性 后 的 PCR产 物 。 80W恒 功 率 电 泳 至 上 部 的 指 示 带 （ 二 甲 苯 青 ） 到 达 胶 板 的 中 部 。C.5 银染电 泳 结 束 后 ， 小 心 分 开 两 块 玻 璃 板 ， 凝 胶 紧 贴 在 长 板 上 。 将 长 板 置 于 固 定 液 中 轻 轻 晃 动 3 min； 双 蒸 水 快 速 漂 洗 1次 ， 不 超 过 10 s； 染 色 液 中 染 色 5 min； 双 蒸 水 快 速 漂 洗 1次 ， 不 超 过 10 s； 显 影 液 中 轻 轻 晃 动 直 至 带 纹 清 晰 ； 固 定 液 中 定 影 5 min； 双 蒸 水 漂 洗 1 min。
