1、.实验七 蛋白质含量测定测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。目的要求1掌握测定蛋白质的含量基本方法。2了解染料法、双缩脲法、Lowry 法和紫外吸收法测定原理。一、染料法实验原理在酸性溶液中染料考马斯亮蓝 G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝 G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从 460nm移至 595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。该法近年在某些方面有取代经典的 Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有
2、一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。器材吸量管； 试管；721 型分光光度计试剂1.标准牛血清白蛋白溶液：配成 0.1mg/ml的溶液。2.待测蛋白质溶液。3.染料溶液：称取考马斯亮蓝 G-250 0.1g溶于 95%的酒精 50ml，再加入 85%的浓磷酸100ml，用水稀释至 1000ml,混匀备用。操作步骤1 标准曲线的绘制：试剂(ml)管号 0 1 2 3 4 5标准蛋白溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0H2O 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0染料溶液 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0A
3、595nm 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min 后在 595nm波长处以 0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。2样品测定：.取 1ml样品溶液（约含 25250 微克蛋白质），加入染料溶液 5ml混匀，5min 后测定其 595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H 2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(CO-NH 2)，或与此相似的基团如CH 2-NH2，CS-
4、NH 2，C(NH)NH 2的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(CO-NH)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为 110mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。试剂1双缩脲试剂： 取 CuSO45H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g 以少量蒸馏水
5、溶解，再加 2.5molL NaOH 溶液 300ml，KI 1.0g，然后加水至 1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。2标准蛋白质溶液： 用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用 BSA浓度 1g/L的 A280为 0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。器材 1试管：15150mm 试管 7只 ； 21ml，5ml 移液管；
6、3坐标纸 ； 4721 分光光度计。操作步骤取试管 7支，编号，按下表操作：试剂(ml)管号 空白管1 2 3 4 5 测定管蛋白标准液（10g/L） - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -生理盐水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 - 0.4.混匀，37水浴 20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长 540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。15 为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度，在标准曲线上求得蛋白质浓度。注意事项1双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu 2+形成稳定的络合铜离子，以防止CuSO45H20不稳定形成
7、Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与 CuSO45H20之比不低于 31，加入KI作为抗氧化试剂。2双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。3本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。4黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰。思考题 1双缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其它还有什么方法测定蛋白质的含量?2请用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法(除标准曲线法外)。三、酚试剂法测定血清蛋白质含量（改良 Lowry法）实验原理蛋白质分子中所含肽键在碱性条件下与铜络合生成复合物产生紫红色化合物（双缩脲反应），同时使肽链展开，蛋白质中半胱氨酸、络氨酸、色氨
8、酸和组氨酸均能使钨酸、钼酸同时失去 1个，2 个或者 3个氧原子，还原成多种还原型的混合酸，并且有特殊的蓝颜色（最大吸收峰波长为 745750nm,反应式一）其蓝色深浅与蛋白质含量在一定范围内成正比，由此可测出样品中蛋白质的含量。同时蛋白质肽键发生烯醇化反应（反应式二）能使钼离子在 pH10时螯合在肽结构中，形成复合物，从而使电子转移到混合酸的显色剂上，大大增加了酚试剂对蛋白质的敏感性。反应式一 3H 2OP2O513WO35MoO310H2O3H2OP2O514WO34MoO310H2O待测样品 - - - - - - 0.1双缩脲试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
9、相当蛋白质（g/L） 0 10 20 30 40 50 .反应式二 3H 2OP2O513WO25MoO310H2O3H2OP2O514WO24MoO210H2O烯醇化反应烯醇化反应后，可与 Cu2+络合，络合后，易于使肽释放电子，使酚试剂还原。试剂器材1碱性铜试剂：甲液：称取无水碳酸钠 2.0g，溶于 0.1mol/L NaOH溶液 100ml中。乙液：取硫酸铜（CuSO 4 5H2O ）0.5g，溶于 1%酒石酸钾溶液 100ml中。临用前取甲液 50ml，乙液 1ml混合，即为碱性铜试剂。此液需现用现配。2标准蛋白质溶液（250 g/ml）：精确称取结晶牛血清清蛋白 25mg，溶于0.9
10、%NaCl溶液中，以容量瓶定容至 100ml。3样品：取血清 0.1ml，置于 50ml容量瓶中，用 0.9%NaCl溶液稀释至刻度处，混匀，为待测血清样品。4.酚试剂：取钨酸钠（Na 2WO42H2O）100g 和钼酸钠（Na 2MoO42H2O）25g,溶于 700ml蒸馏水中，再加入 85%磷酸 50ml和浓硫酸 100ml充分混匀，置于 1500ml圆底烧瓶中温和地回流 10小时，冷却，取下冷凝装置，再加入硫酸锂（Li 2SO42H2O）150g,水 50ml,溴34 滴，开口继续沸腾 15分钟，驱除过量的溴，冷却后稀释至 1000ml，过滤，溶液应呈黄色或金黄色（如带绿色不能使用，应
11、继续加溴煮沸），置于棕色瓶中保存。使用前，以酚酞为指示剂，用 0.1mol/LNaOH溶液滴定，求出酚试剂的摩尔浓度。然后根据此浓度，将酚试剂用蒸馏水稀释至最后酸度为 1mol/L。（滴定时可将酚试剂稀释，以免颜色影响）。试剂放置过久，变成绿色时，可再加溴数滴煮 15分钟，如能恢复原有的金黄色仍可使用。5721 分光光度计；旋涡混合器；秒表；试管。操作步骤取试管 7支，编号，按下表操作：试剂（ml）管号 O 1 2 3 4 5测定管标准蛋白溶液（250g/ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 稀释血清 1.00.9%NaCl 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 碱性铜试剂 5.0
12、 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0混匀，室温放置 20min酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5.混匀，室温放置 30min后，以 0管调零点，在波长 650nm比色，分别读取各管吸光度值。以蛋白质含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。以测定管吸光度值，查标准曲线求得血清蛋白质含量。临床意义1.血清总蛋白浓度增高：（1）血清中水分减少，而使蛋白浓度相对增高。如急性失水时（呕吐、腹泻、高热）；休克时，由于毛细管通透性的变化，血浆也发生浓缩等。（2）蛋白合成增加，大多数发生多发性骨髓瘤患者中，主要是血清球蛋白增加。2血清蛋白合成降低：（1）合成障碍，
13、主要为肝功能障碍，肝脏是合成蛋白质的场所，肝功严重损害时，蛋白质的合成减少，以白蛋白最为显著。（2）蛋白质丢失，如严重灼伤时，大量血浆渗出；肾病综合症时，尿液中长期丢失蛋白质等。（3）营养不良或长期消耗性疾病，如严重结核或长期消耗性疾病。（4）血液中水分增加，血浆被稀释，因各种原因引起的水钠潴留或输注过多低渗溶液。注意事项1.酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性铜试剂是在碱性条件下与蛋白质相互作用，所以当加入酚试剂后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。2.碱性铜试剂必须临用前配制。3.磷钼酸、磷钨酸的显色反应是由于和还原物质的还原反应而引起的，因此本法可受很
14、多还原性物质的干扰，如带有-SH 的化合物，糖类、酚类等甚至有些缓冲剂（如 Tris）也能干扰测定。但如控制在低浓度范围内，则不影响测定，Lowry 法很灵敏，可以对5100g 蛋白质样品进行很好的显色反应，而如此低的蛋白质浓度常常已把干扰物质的浓度稀释到一个不起作用的水平。4.所有器材必须清洗干净，否则影响实验结果。5.血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围内，若超过此范围需要将血清酌情稀释。6.本法操作简便、灵敏度高，缺点是试剂只与蛋白质中半胱氨酸、色氨酸等起反应，因此可因各种蛋白质中含这几种氨基酸的量不同使显色强度稍有不同。思考题1.用酚试剂法测定蛋白质含量有哪些优点？2.用酚试剂法
15、测定蛋白质含量有哪些干扰作用？应如何注意？.四、紫外吸收法实验原理蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在 280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在 238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH 4） 2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对
16、值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因 pH的改变而有变化，因此要注意溶液的 pH值，测定样品时的 pH要与测定标准曲线的 pH相一致。试剂器材1蛋白质标准液（
17、1mg/ml）： 准确称量经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质配制。2紫外分光光度计。操作步骤1.标准曲线的绘制：取 8支试管，按下表编号并加入试剂：试剂（ml）管号 0 1 2 3 4 5 6 7蛋白质标准液（1mg/ml）蒸馏水04.00.53.51.03.01.52.52.02.02.51.53.01.04.00混匀。在 280nm处测定各管溶液的吸光度值。以 0号管调零，以蛋白质溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出蛋白质标准曲线。2.蛋白质样品溶液，在 280nm处测得吸光度值，从标准曲线上查出其浓度。注意事项1.蛋白质的最高吸收峰可因 pH的改变而发生变化，因此要注意保持待测蛋白质
18、溶液的 pH值与标准蛋白质溶液一致。2. 测定液必须澄清，以免造成结果误差。.3本法需用石英比色杯。思考题1为什么紫外吸收法可作为蛋白质定量测定方法？其理论依据是什么？2此法测定蛋白质具有什么特点？实验二十一 紫外光吸收法测定蛋白质浓度 目的和要求 了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理。熟悉紫外分光光度计的使用。原理 蛋白质组成中长含有酪蛋白和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm 波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。由于核酸在 280nm 波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在 260nm 处。
19、如同时测定 260nm 的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此如溶中存在核酸时必须同时测定 280nm 及 260nm 的吸光度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。操作步骤 一.直接测定法.在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为对照，测得 280nm 和 260nm 两种波长的吸光度（A280nm 及 A260nm）。将 A280nm 及 A260nm 波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度。C = 1.45A280nm 0.74 A260nm式中 C：蛋白质质量浓度（mg/ml ）；A280nm：蛋白质溶液在 280nm 处测得的吸光度；
20、A260nm：蛋白质溶液在 260nm 处测得的吸光本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况，这时用其他方法测定往往较困难。为方便起见对于混合蛋白质溶液，可用 A280nm 乘以 0.75 来代表其中蛋白质的大致含量（mg/ml ）。（二）标准曲线 标准曲线的绘制取 8 支干净试管，编号，按下表加入试剂。.管号试剂0 1 2 3 4 5 6 71mg/ml 卵清蛋白标准液/ml蒸馏水 /ml蛋白浓度/（mg/ml ）A280nm04.000.53.50.1251.03.00.251.52.50.3752.02.00.52.51.50.6253.01.00.754.
21、001.0加毕，用紫外分光光度计测 A280nm，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。 样液测定取未知浓度的蛋白液 1.0ml，加蒸馏水 3.0 ml，测 A280nm，对照标准曲线求得蛋白质浓度。试剂和器材一、试剂 1. 卵清蛋白标准液：约 1g 卵清蛋白溶于 100ml0.9%NaCl 溶液，离心，取上清液，用克氏定氮法测定其蛋白质含量。根据测定结果，用.0.9%NaCl 溶液稀释卵清蛋白溶液，使其蛋白质含量为 1mg/ml。亦可用 1mg/ml 的牛血清白蛋白溶液。2. 未知浓度蛋白质溶液：用酪蛋白配制，浓度控制在 1.02.5mg/ml范围内。或用稀释血清代替：准确吸取 0.1ml 血清置于 50ml 容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度。 0.9%NaCl。二. 器材1. 752 型分光光度计。 2. 容量瓶 50ml（1）。 3.试管 1.5cm15cm(9)。4. 吸管 0.50ml（1）、 1.0 ml（3）、2.0ml（2）、5.0ml（2 ）。思考题 1.紫外吸收属于光谱光度分析的哪一类？其基本原理是什么? 2.若样品中含有核酸类杂质，应如何校正?
