1、.丙型肝炎病毒细胞和动物模型的研究进展摘要：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一，目前全世界约有 1.7 亿人感染 HCV。由于缺少有效的 HCV 细胞培养系统和小动物模型，人们对其生活周期、作用机制等仍不是很清楚，从而严重阻碍了 HCV 疫苗及治疗药物的开发与研制。本文就近几年在 HCV 细胞和动物模型方面的进展作一综述。关键词：丙型肝炎病毒 细胞模型 动物模型Progress in Establishment of HCV Cell and Animal ModelAbstract: Hepatitis C virus(HC
2、V) is a major cause of chronic liver disease, such as chronic hepatitis, hepatic cirrhosis, hepatocelhlar carcinoma, with over 170 million persistently infected individuals worldwide. Lack of proper study models has brought difficulties in the study of the mechanism of viral infection, life cycle an
3、d pathogenic mechanism of HCV and also become the major obstacles in the development of efficient vaccine and new drugs for hepatitis C. Here the advances on establishment of HCV infectious cell and animal models were reviewed.Key Words: Hepatitis C virus(HCV); cell model; animal model丙型肝炎是全球关注的公共卫生
4、难题，目前全球约有1.7亿人感染HCV，我国进行的全国HCV 血清流行病学调查显示，我国一般人群抗-HCV阳性率约为3.2%，全国共约4000万人感染HCV，HCV是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。约50-80的 HCV感染者会转变为慢性感染患者，而大约20 的患者会在20年内转变为肝硬化。一旦转为肝硬化，每年将会有 15的病人发展成为肝癌，严重地威胁着人类的健康。长期以来，缺少合适的研究模型一直是HCV研究的瓶颈，近年来HCV体外培养系统的建立使其相关研究提供了强有力的工具，为从根本上认识HCV奠定了基础。本文概述了近年来HCV研究模型的开发进展。1 HCV的基本分子生物学特征HC
5、V属黄病毒科丙型肝炎病毒属，为单股正链RNA 病毒，基因组全长9.6 kb，含有一个开放的编码区，可编码一个多聚蛋白前体，此多聚蛋白前体由宿主和病毒的信号肽酶剪接成3个结构蛋El（Core、E1、E2 ）和7个非结构蛋白（NS1、NS2 、NS3 、NS4A、NS4B 、NS5A 、NS5B）。HCV C蛋白由191 个氨基酸残基组成，是HCV基因组中较为保守的结构区域。5UTR区最为保守，而3UTR对于HCV RNA的正常复制是不可缺少的（图1） 1。.图1 HCV基因组结构2 HCV的细胞模型2.1 感染模型 感染是建立HCV细胞模型最简单直接的方法，是用HCV 阳性血清直接和HCV 敏感
6、细胞共同培养使细胞感染。早在1992年，Shimizu等 2报道用鼠逆转录病毒感染人T淋巴细胞系MOLT-4Ma和HPB-Ma，再用可连续感染大猩猩的病毒株和上述细胞共培养，24 d后仍可在细胞内检测到病毒RNA的存在。随后用人淋巴细胞白血病病毒HTLV-I 预处理MT-2细胞系后再用HCV感染也得到类似的结果。研究人员分别在HPB-Ma、PBMC、Huh-7、Hep-G2和其他SV-40 T抗原永生化肝脏细胞系上也建立了HCV 持续感染系统，同时观察到此感染效率与病毒体内滴度密切相关，并可被相应抗体中和和干扰素抑制持续复制的病毒直径约为50 nm，采用RT-PCR方法可间隙性检测出。Iaco
7、vacci 等 3则选用人胎肝细胞作为培养HCV的靶细胞，用竞争性PCR定量检测病毒RNA 分子，发现培养后30d 达到HCV复制水平的最高值。他们还发现血清中病毒颗粒的蔗糖梯度密度为1.181.36g/cm 3，而细胞和上清中检测到的病毒颗粒密度有高低两种（高：1.181.36 g/cm3；低：1.051.105 g/cm3）。Rumin等 4用HCV阳性血清和人肝细胞共同培养，观察4个月，发现这些感染细胞在10d 后可检测到正链RNA ，而培养上清中的RNA 滴度在3个月中也有了升高。而Yoshikura H等 5用HCV患者血清感染细胞时，也发现了病毒颗粒密度有高低两部分，密度高的部分感
8、染性低，低密度的感染性高。对于这种现象，他们认为可能是HCV颗粒结合了抗HCV抗体，导致了密度的增加，同时干扰了HCV对细胞的吸附及在细胞中的复制，使HCV对细胞的感染性降低。用抗人免疫球蛋白对这种血清进行免疫检测，证实了低感染性高密度HCV确实结合有IgG 抗体。用阳性血清感染细胞方便快捷，缺点但病毒复制产量较低，且不能长期传代培养。2.2 转染模型.具体做法是利用RT-PCR方法获得的全长HCV cDNA，采用各种方法将其转染进入易感细胞，通过胞内逆转录可产生和病毒相同的RNA转录本，从而模拟病毒的感染过程。相对于HCV病毒直接感染的细胞培养系统，克隆的病毒基因组转染模型保证了用于感染细胞
9、的基因组的同源性，且能够在体外大量合成。Kishine等 6从感染细胞提取HCV RNA，逆转录出cDNA，将其改造后（ 剔除结构基因，保留与复制有关的非结构基因和3NCR、5NCR，以保证不影响复制）整合入pBR322MC中，并插入抗Huh-7 基因、ECMV-IRES，构建重组质粒pNNR22RU，转染Huh-7 细胞培养，再从中选择抗G418的Huh-7 细胞进行亚克隆。最后从这些细胞克隆中检测到病毒产物（ 非结构蛋白）和亚基因RNA。实验结果表明HCV 亚基因复制子能在一些细胞培养系统中有效复制，并维持较长的时间，有利于将来进一步研究丙肝病毒复制机制及新药筛选。Pietschmann等
10、 7把构建好的选择性全长 HCV基因转入Huh-7 中，并进行3 个突变来加强在细胞中的复制，结果发现能在细胞中持续检测到该基因达6个月，结构蛋白稳定表达。Lohmann等 8在研究HCV 在细胞中复制时，发现Huh-7 是较好的病毒培养的细胞系统。选择性亚基因复制子也需要核苷酸突变来加强病毒复制，NS3的突变对复制作用小，但在联合高适应性突变时能加强病毒复制；而NS5、 NS4B 的适应性突变作用可直接加强复制。另外也发现宿主细胞在RNA 有效复制时也起了非常重要的作用，他们检测了相同Huh-7 细胞系的几代，发现不同代次的 Huh-7在支持复制子扩增的能力相差100倍。这些数据资料表明在细
11、胞培养中HCV 的复制有效性很大可能是由病毒序列和宿主细胞本身共同决定的。3 动物模型3.1 黑猩猩黑猩猩是公认的最好的HCV感染实验动物。已经证实HCV在黑猩猩体内复制，黑猩猩对HCV 的应答过程与人类相似。Shimizu等 2研究发现，黑猩猩接种HCV 后3-4天即可于血清中检测出HCV RNA，7天时HCV RNA水平达到峰值，为10 7-108CID/L，同时血清ALT 水平最高。感染后3天，肝细胞活检可检测到HCV RNA。同人类一样，感染HCV 的黑猩猩中有很大比例 40%由于机体免疫系统不能清除病毒，而发展成持续性感染。人与黑猩猩在HCV 转为慢性感染的比例上的差别，可能是因为有
12、许多患者急性期临床表现不明显而未能发现。但HCV 在宿主体内是如何逃避免疫监视而发展为慢性感染的机理仍不清楚。病理学研究表明，黑猩猩的肝脏损害没有人类严重，观察不到肝纤维样变性和肝硬化，但在组织形态学和坏死性炎症病变方面与人相似。总的来说，在人和黑猩猩身上所观察到的临床参数比较接近，用黑猩猩来研究病毒在体内复制情况和发病机理及筛选HCV疫苗都是非常有价值的。但由于黑猩猩作为丙肝模型缺乏慢性肝病的表现，使得在肝硬化和肝细胞癌发病机理的研究方面受到限制 9。此外，费用等问题也限制了它的应用范围。3.2 猴GBV-B是近年来发现的黄热病毒属中的一员，是一种单股正链RNA 病毒，在所有的动物病毒中，.
13、GBV-B与HCV有高度核酸同源性，其多聚蛋白在氨基酸水平上有 2530的同源性，因此推想治疗HCV感染的抗病毒化合物同样会对GBV-B有作用，使得GBV-B作为HCV的替代病毒建立感染模型成为可能。GBV-B可以感染绒猴， GBV-B感染绒猴40-60 d后可达到 108109拷贝，60-80 d后病毒逐渐被清除。原代培养的绒猴肝细胞培养上清中及细胞中也成功地检测到了GBV-B的感染。用HCV 蛋白酶抑制剂可以有效降低体外培养绒猴肝细胞上清中及绒猴体内的病毒含量。Martin等 10用合成的GBV-B RNA直接注射入小绢猴的肝脏，可诱使其产生持续性GBV-B感染，两个感染动物中有一个感染后
14、病毒血症超过2年，且出现了门静脉周围单核细胞浸润、线粒体结构改变及脂肪变性等慢性肝炎的组织病理学改变 11。近年有关猴作为HCV感染模型的报道不多，其作为可供研究HCV使用模型的可能性有待验证。3.3 树鼩树鼩是一种与灵长类亲缘关系较近的哺乳动物，对多种人类病毒，包括甲、乙和丁型肝炎病毒易感。Xie等 12对树鼩进行病原接种发现，仅有1/4能感染HCV，在体内检测到短暂或间歇的低效价病毒血症。 若树鼩接受cGy750 照射后再进行病原接种，HCV 感染效率、病毒血症及抗体效价均明显提高。但由于树鼩是野生动物，实验室饲养困难，广泛应用受到限制。3.4 小鼠3.4.1 转基因小鼠模型小鼠主要有转基
15、因小鼠模型、质料转染鼠模型和人鼠嵌合体肝移植鼠模型。转基因技术自1980年代初发展起来现已成为生命科学领域中普遍应用的常规技术手段，HCV转基因小鼠主要为结构基因转基因小鼠，在病毒导致肝炎、肝脂肪及肝癌的致病机制方面的研究起了很大的作用。Pasquinelli等 13将编码HCV结构蛋白的C、E基因分别插入到鼠主尿蛋白下游，建立携有HCV基因片段的转基因小鼠。这种对T细胞免疫应答功能的抑制可能是由于HCV感染增强了T 淋巴细胞对Fas-介导的细胞凋亡的敏感性，HCV核心蛋白可能是通过促进Fas-介导的T 淋巴细胞凋亡以及肝脏的T 淋巴细胞浸润而导致肝损伤。HCV各组成蛋白的致癌机制也是以HCV
16、 转基因小鼠模型进行研究的，Kato等 14发现在饲养了1824个月后，HCV核心基因转基因小鼠的肝脏内均未出现肿瘤，但是经四氯化碳处理后可发生肝细胞癌，因此认为HCV核心蛋白导致的肝细胞再生速率的提高可能是增强肝脏发生癌变机率的机制之一。成军等 15发现约80%的HCV结构基因的转基因小鼠模型发生肝脏等内脏的脂肪变，为研究HCV慢性感染引起的脂肪变奠定了基础。Kamegaya等 16将 HCV E1蛋白、E2蛋白和核心蛋白的转基因小鼠用DEN处理后于第32周处死，然后检测细胞的增殖和凋亡情况，发现两组小鼠与正常小鼠间的细胞增殖没有显著差别，但核心-E1-E2 转基因小鼠的较大，而凋亡指数却小
17、于核心基因转基因小鼠，因而认为HCV结构蛋白促进肿瘤生成的原因可能是由于抑制肝细胞凋亡而并不是促进肝细胞增殖。虽然转基因小鼠作为HCV感染模型的报道较多，但各方研究不尽相同，且存在很多问题，转基因小鼠处于免疫耐受状态，对HCV导致肝细胞损伤的原因，究竟是病毒的直接作用还是病毒与机体免疫系统的相互作用尚有争议，并难以用于疫苗的研发。.3.4.2 质粒转染鼠模型由于HCV病毒不能直接感染小鼠，因此人们尝试用含有HCV的质粒转染小鼠肝细胞或体内转染的方法表达HCV蛋白。詹林盛等 17用含内部核糖体起始位点IRES的HCV 5NCR及部分多聚蛋白起始区序列与荧光素酶基因融合，然后插入含CMV 启动子的
18、Pci-neo质粒中，得到真核表达质粒Phcv-neo4，进一步采用水动力转染法将pHCV-neo4表达载体转染到小鼠体内，在小鼠肝脏检测到荧光素酶的高水平表达，同时HCV IRES介导的荧光素酶在小鼠心、脾、肾脏组织中也得到表达，但表达量仅为肝脏的1 100 l1 000，可以作为体内瞬时评价以HCV IRES为靶位的抗HCV药物活性的小鼠模型。3.4.3 人鼠嵌合体肝移植鼠模型此方法是在免疫缺陷小鼠体内移植人肝细胞，通过肝门静脉或脾髓注射，使小鼠感染HCV。Brown等 19利用原代或无限增殖的人肝细胞进行实验，结果表明所建立的HCV小鼠模型可用于HCV的体内研究。Mercer等 20通过
19、在纤维蛋白溶酶原激活蛋白转基因的SCID小鼠肝脏内植入正常人肝组织，然后接种HCV患者血清建立了一种HCV嵌合感染的小鼠模型，该小鼠的肝脏中能检测到病毒RNA的复制。其体内病毒滴度最高能达到1:1950 ，而且这种感染能连续传递三代。Galun等 21采用的方法是给免疫缺陷小鼠（BNX）以放射性照射，然后用免疫缺陷小鼠的骨髓细胞进行重建，再把感染了HCV患者的肝碎片移植到用前述方法所制备的小鼠肾被膜下。这种三联体小鼠在移植后1015天内，有50%以上用RT-PCR法可以检测到HCV RNA。Ilan等 22报道三联体HCV小鼠感染率为 85%，且可以用抗病毒药物减轻小鼠的病毒血症，但这种方法由
20、于免疫排斥，肝存活时间较短，且病毒血症水平较低，而影响该鼠对人肝细胞产生免疫耐受。4 结语近几年，在建立HCV动物模型技术上有了很大突破。新的动物模型基本上都是在人鼠嵌合体转基因小鼠基础上建立的，必将为HCV 的研究带来新的突破。鼠的免疫缺陷恰恰能满足异种动物成分的介入，从而扩大了HCV模型的应用。但是还有待于进一步研究更加方便、精确的小动物模型，进行有关发病机制、药物以及疫苗方面的研究。参考文献1. Ciesek S, Steinmann E, Wedemeyer H, et al. Cyclosporine A inhibits hepatitis C virus nonstructura
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