1、1急 性 毒 性 试 验 方 法改良寇氏法Krber 法由 Krber 于 1931 提出，后经 Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963 年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含 0%和 100%死亡率的校正式，所得 LD50及全部有关参数与正规概率单位法相近。改良寇氏法（Kber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在 10%50%之间，另一半在 50%100%之间，最好出现 0 %和 100 %的剂量组。一、剂量选择及分组1、剂量选择 剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。探求外源化学物的急性毒性
2、，测定其 LD50或 LC50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定 LD50的计算方法，然后设计剂量。2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b）和全部不致死的最大剂量（a） ，即求出待测化学物 0 %100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计 57 个剂量组，组间剂量呈等比级数（ r） ，其比值为1.21.5。进行正式实验。用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠 180200g，小鼠 1822g，豚鼠
3、 200250，家兔 22.5kg，犬 1012 kg。用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的 20%。仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的 LD50。通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。按下式设计剂量组：1nabr式中：r相邻两组剂量的比值，一般为 1.21.5，b最低全致死剂量量，a最高不致死剂量，n设计的组数。分组恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。因为组数过多，需要消耗较多的动物，还可能出现较大剂量组动物死亡率低于较
4、小剂量组；组数过少，不能较精确求出 LD50。3、根据公比(r)计算各组剂量各组剂量分别为：第一组：a第二组：a r 2第三组：a r 2 第四组：a r 3第五组：a r 4 第六组：a r 5 二、受试物溶液配制1、溶剂的选择 毒理学试验中，常用的剂型有液体剂型、固体剂型。液体剂型中有溶液剂、混悬剂、乳化剂等。选择溶剂的原则是不与受试物发生化学反应，不改变化学物的毒性，故应根据受试物的理化性质，选择适当的溶剂。一般而言，水溶性化学物可选择蒸馏水或生理盐水，以水为溶剂，既经济、方便、易吸收，又无毒副作用。脂溶性化学物多选用植物油，如花生油、橄榄油。不溶于水而溶于油的化学物常用吐温-80 或吐
5、温-60 配制成乳化剂。既不溶于水又不溶于油脂的化学物可选择淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素钠液（0.5-1% CMC）等助悬剂配制成混悬液。如用有机溶剂，实验动物应设溶剂对照组，有机溶剂所用比例不宜超过 10%，溶解后，再用水稀释，必要时可加入增溶剂，如吐温-80、聚乙二醇等，以提高溶液剂的浓度。2、配制方法 受试化学物的配制方法有等浓度稀释法和等容量稀释法。等浓度稀释法 将受试物配制成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积不同，剂量越高，所用的体积越大；剂量越低，所用的体积越小。比如某受试物的试验剂量分别为100、200、400 和 800mg/kg，受试物配制成 10 mg/m
6、l，每组动物每 10g 体重分别给与 0.1、0.2、0.4 和0.8 ml。等容量稀释法 将受试物配制成不同浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同，剂量越大，受试化学物配制的浓度越高。上例中，若实验动物按 0.2ml/10g b.w 容量灌胃,则应配制成 4个不同浓度,即 5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml 和 40mg/ml。灌胃体积依所选用的实验动物而定，一次灌胃的体积为：小鼠 0.1 0.4ml/10g b.w，每只不超过 1ml；大鼠0.5 1ml/100g，每只不超过 4ml;家兔在 5ml/kg 之内 ;犬不超过 50ml/kg；为避免操作误差，等容量稀释
7、的传统方法常采用 1K 系列稀释法。该法操作简便、浓度精确、节约受试化学物。a、 确定各剂量组所需受试液浓度如已知最高剂量组剂量为 2000mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法给予受试药液，即 0.2ml/10g b.w.，相当于 20ml/1000g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为 2000 mg/20ml，即 10.0%（C 1） 。b、 确定每组所需受试液的量（m ml）按每只鼠体重 25g 计算（将损耗也计算在内） ，给药量为 0.2ml/10g b.w.，则每组 10 只动物所需受试液的量为 5ml；c、 确定母液总量配制时，根据实验设计要求确定最高剂量组所需
8、受试化学物的浓度和总体积，配制母液。设母液浓度为 C1，各组所需要的量为 m ml，母液应配制的总量 M 用下述公式计算：3K1mM式中， K 为各组剂量的比值，K=1/r。d、 配制母液选择适当的溶剂配制浓度为 C1 的受试液，取 M ml 作为母液，从母液中取出 m ml 供最高剂量组染毒用；然后取 m ml 溶剂加入剩余的母液中，混匀，稀释后的母液浓度为 C2（C 1 ：C 2=1：k= r） ，即次高剂量组所要求的浓度，从中取出 m ml 供次高剂量组染毒用（第 2 组） ，然后再加入 m ml 溶剂，其稀释后的浓度为 C3（C 2 ：C 3=1.2） ，取出 m ml 供第 3 组动
9、物染毒用。依此类推，可配制成按 1K 递减的各剂量组不同浓度的试液。三、染毒各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即 0.2ml/10g b.w.。四、观察指标与试验期限急性中毒症状及出现时间，死亡数量、时间。大体剖检变化。试验期限为 7-14 天五、结果及 LD50 的计算采用寇氏法计算 LD50 及其 95%可信限1、试验结果列表表 试验结果组别 剂量（ mg/kg）试验动物数 死亡动物数 死亡率（p） 存活率（q）1 102 103 104 105 102 计算 LD50当急性毒性试验的最大剂量死亡率为 100%，最小剂量的死亡率为 0%；各组动物数相等；各剂量组的组距等比或剂
10、量对数等差时，用下述基本公式计算 LD50： )5.0p(iXlogLDm150当不含 0%和 100%死亡率时，用下式计算 LD50： )4P3(il n150npqiS50x4以上各式中：i组距，即相邻两组剂量对数剂量之差Xm最大剂量对数P各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示)Pm最高死亡率q各组剂量存活率，q=1-pPn最低死亡率p各剂量组死亡率之和n各组动物数Sx50logLD50 的标准误LD50 的 95 %可信限=log -1(log LD501.96Sx50) 改进 Krber 法的优点是计算简便、结果精确，实用性大。我国新兽药一般毒性试验技术要求规定用此法计算新兽药的 LD50
11、。举例：给小鼠口服某药进行急性毒性试验，测定 LD50。选择体重 1824g 健康小鼠（雌雄各半） ，按随机方法将动物分为 5 个组，每组 10 只。经预试找出死亡率在 0100%的剂量范围大约为 300600mg/kg b.w. 。（1) 预试（略）（2） 计算公比1nabrr= 5-1 600/300 =4 2 =1.189 1.2 ?（3） 根据公比(r)计算各组剂量因而各组剂量分别为：第一组：a=300mg/kg b.w.第二组：a r =3001.2 = 360mg/kg b.w.第三组：a r 2 =3001.2 2 = 432mg/kg b.w.第四组：a r 3 =3001.2
12、 3 = 518mg/kg b.w.第五组：a r 4 =3001.2 4 = 622mg/kg b.w.（4） 受试液配制采用 1：K 系列稀释法配制不同浓度的受试液。 （K1/r）a、 确定各剂量组所需受试液浓度：已知最高剂量组剂量为 622mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法给予受试药液，即 0.2ml/10g b.w.，相当于 20ml/1000g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为 622 mg/20ml，即 3.11%（C 1） ；b、 确定每组所需受试液的量按每只鼠体重 25g 计算（将损耗也计算在内） ，给药量为 0.2ml/10g b.w.，则每组 10
13、只动物所需受试液的量为 5ml；5c、 确定母液总量各组动物需用本组浓度受试液的用量为 5 ml（m） ；各剂量组之比为 0.833（k=1/ r） ，则母液应配制的总量为（ml）：510.833d、 配制母液选择适当的溶剂配制浓度为 3.11%（C 1）的受试液，取 30 ml 作为母液，从母液中取出 5ml 供第五组（最高剂量组）接毒用，然后取 5 ml 溶剂加入 25ml 母液中混匀，稀释后的母液浓度为 2.59%（C 2） （C 1 ：C 2=1：k=1.2） ，即第四组（次高剂量组）所要求的浓度，从中取出 5 ml 供第四组接毒用，然后再加入5 ml （ ml）溶剂，其稀释后的浓度为
14、 2.16%（C 3） （C 2 ：C 3=1.2） ，即第三组所需的浓度。依此类推，可配制第二组、第一组所需浓度的受试液，分别为 1.80%、1.50%（5） 接毒各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即 0.2ml/10g b.w.。（6） 观察指标（7） 结果及 LD50 的计算采用寇氏法计算 LD50 及其 95%可信限a、将试验结果列入下表，按改良寇氏法进行计算；表 试验结果组别 剂量（ mg/kg）试验动物数 死亡动物数 死亡率（p） 存活率（q）1 300 10 0 0 1.02 360 10 2 0.2 0.83 432 10 5 0.5 0.54 518 10 7
15、0.7 0.35 622 10 10 1.0 0b、按下列公式计算： )5.0p(iXlogLDm150即：logLD 50=Xmd（p 0.5）Xm=log622=2.7938=29.999930（ml）6i=log 1.2=0.0792p=0+0.2+0.5+0.7+1.0=2.4代入公式：logLD 50= 2.79380.0792（2.40.5）=2.6433c 查反对数求出 LD50=439.87 mg/kg b.w.。d 计算 LD50 的标准误（S ）：npqi50x=0.07920.249=0.0197 e 计算 LD50 的 95%可信限：LD50 的 95%可信限= log 1（logLD 501.96SlogLD50）= log1（2.64331.960.0197）= log1（2.64330.0386）= log 1（2.60472.6819）=402.44480.73 mg/kg b.w.
