1、遺傳物質的分子架構與特性,遺傳物質必需具備那些特點？ 1)在體細胞中含量穩定； 2)在生殖細胞中含量減半； 3)能攜帶遺傳資訊； 4)能正確地自我複製； 5)能發生變異；,1869年，F.Miescher從膿細胞中萃取到一種富含磷元素的酸性化合物，稱核素。,18851900年間，Kossel、Johnew、Levene證實核酸由不同的鹼基組成。其最簡單的單體架構是鹼基-核糖-磷酸構成的核苷 酸。1929年又確定了核酸有兩種，一種是去氧核糖核酸(DNA)，另一種是核糖核酸(RNA)。, 遺傳物質的發現,1928年Frederick Griffith 轉型實驗,1944年，Avery在離體條件下完
2、成轉型作用,人們仍不相信DNA是遺傳物質,這是由於,（1)因認為蛋白分子量大，架構複雜，二十種氨基酸的排列組合將是個天文數字，可作為一種遺傳資訊。而DNA分子量小，只含4種不同的鹼基，在當時人們一度認為不同種的有機體的核酸只有微小的差異。 （2)認為轉型實驗中DNA並未能萃取得很純，還附有其它物質。 （3)即使轉型因子確實是DNA，但也可能DNA只是對莢膜形成有著直接的化學效應，而不是充當遺傳訊息的載體。,1952年，Hershey和Chase 噬菌體感染實驗,遺傳物質是DNA怎麼被證實的？,RNA也是遺傳物質,1956年A.Gierer和G.Schraman發現煙草相嵌病毒（tobacco
3、mosaic virus,TMV），其遺傳物質是RNA。 1957年美國的Heinz Fraenkel-Conrat和B.Singre用重建實驗證實了這一結論。,DNA和RNA的 化學組成及雙螺旋模型,DNA和RNA的化學組成四種核苷酸假說不同DNA的成分都是相同的。1950英Chargaff，發現DNA的“察加夫法則”。 Alfred,Mirsky,Hars,Ris& R.Vendrely,A.Boivin兩組學人分別發現不同的生物體細胞中DNA的含量都是其配子中的兩倍。,DNA雙螺旋模型的誕生,Watson &Crick建立雙螺旋模型主要是受到4個方面的影響 （1）1938年W.T.Ast
4、bury &Bell用X光繞射技術研究DNA。1947年拍攝了第一張DNA的繞射照片，並推斷DNA分子的架構是柱狀；多核苷酸是一疊扁平的核酸；核酸鹼基取向和分子長軸垂直,間距為 3.4nm。,（2)1951年Pauling和Corey運用化學的定律來推理，而不做具體的實驗，建立了蛋白質的-螺旋模型； （3)晶體學人美J.Donoh &Chargaff的指點。 （4)R.Franklin &Wilkins在1952年底拍得了DNA結晶X繞射照片。,1951年，Pauling提出了蛋白質的-螺旋架構。,1952年，Wilkins和Franklin用高度定向的DNA纖維作出高品性的X-光繞射照片,1
5、953年，Watson和Crick提出DNA的反向平行雙螺旋模型,1962年，Wilkins、Watson和Crick共獲諾貝拉化學獎。,雙螺旋模型(double helix model),雙螺旋模型有以下特點(1)DNA分子由兩條的多核苷酸鏈組成， 形成雙股螺旋。 (3)兩條鏈反向平行，即兩條鏈的方向相反； (4)糖-磷酸鍵是在雙螺旋的外側，鹼基對與軸線垂直。 (5)去氧核糖與附著在糖上的鹼基近似於垂直。 (6)鹼基配對時，必須一個是嘌呤，另一個是嘧啶。 (7)DNA雙螺旋有大溝（major or widegroove）和小溝（minor or narrow groove）的存在。,5,3,
6、3,5,B型雙螺旋DNA的架構特徵,B型DNA僅僅是眾多DNA雙螺旋構象中的一種。在外界條件的改變下，雙螺旋的構象也會改變。,模型中的鹼基配對有何重要性？,A-T,G-C配對可形成很好的線性氫鍵；A-T對和G-C對的幾何形狀一樣，使雙鏈距離相近，使雙螺旋保持均一；鹼基對處在同一平面內。不論核苷酸的順序如何，都不影響雙螺旋的架構；為DNA半保留複製奠定了基礎。,DNA的架構和性質,一DNA二級架構的穩定原素(1)鹼基對之間的氫鍵。(2)鹼基的堆集力。它包括疏水作用；凡德瓦作用力；磷酸基的負電荷斥力；,鹼基配對及氫鍵形成,二. 雙螺旋架構的構象變異,DNA的二級結構種類目前已知有 A，B，C，D，
7、E，T，Z 7種。引起DNA雙鏈構型改變有以下原素 （1）核苷酸順序； （2）鹼基組成； （3）鹽的種類； （4）相對濕度。,Z-DNA的發現 1972年Pohl et al 發現 poly(dG-dC)在高鹽下旋光性發生改變； 1979年Wang A.H-J(王惠鈞), A.Rich對 d(CGCGCG)單晶作X繞射分析提出ZDNA模型,三 左旋DNA,（一）Z-DNA的架構特點(1)糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。(2)左旋。(3)分子外形呈波形。(4)大溝消失，小溝窄而深。(5) 每個螺旋有12bp。,目前已知DNA雙螺旋架構可分為A、B、C、D及Z型等數種，除Z型為左手雙螺旋
8、外，其餘均為右手雙螺旋。,Z-DNA B-DNA,四、DNA的三級架構,所謂DNA的三級架構，是指在一二架構基礎上的多聚核苷酸鏈上的捲曲。在一定意義上，是指雙螺旋基礎上的捲曲三級架構包括鏈的扭軟和超螺旋或者是單鏈形成的環或是環類DNA中的連環體,超螺旋（Supercoied）,鬆弛型DNA （relax form）。 超螺旋（Supercoied） DNA，負超螺旋 正超螺旋檢測DNA三級架構的方法密度梯度離心凝膠電泳電子顯微鏡觀察,（一）DNA的超螺旋架構,原核生物DNA的三級架構 絕大多數原核生物的DNA都是共價封閉的環類雙螺旋。如果再進一步盤繞則形成麻花狀的超螺旋三級架構。,DNA Re
9、striction enzyme map,中心法則,1.自我複製依據中心法則，DNA可自我複製，產生新的DNA分子。2.轉錄作用DNA可作為鑄模，合成RNA，DNA分子中的鹼基序列(遺傳密碼)，RNA的鹼基序列(密碼子)，這過程稱為轉錄作用。,3.轉譯作用在轉譯作用的過程中，鹼基序列所隱藏的資訊則轉換為蛋白質分子中的胺基酸序列。4.蛋白質的合成DNA的遺傳資訊沿著下圖的方向流動，並藉轉錄作用和轉譯作用而合成蛋白質。蛋白質酵素可摧化各種物質的合成，而表現出遺傳性狀。,中心法則1,DNA的複製與生物遺傳資訊的儲存 DNA複製的要點是 1）在複製開始階段，DNA的雙螺旋拆分成兩條單鏈。,DNA的複製
10、,2）以DNA單鏈為模板，按照鹼基互補配對的原則, 在DNA聚合酶催化下，合成與模板DNA完全互補的新鏈，並形成一個新的DNA分子。,3) 透過DNA複製形成的新DNA分子, 與原來的DNA分子完全相同。 經過一個 複製週期後，子代DNA分子的兩條鏈中，一條來自親代DNA分子，另一條是新合成的，所以又稱為半保留複製。,DNA複製過程,基因的轉錄 mRNA的合成,基因轉錄是以DNA為模板合成與其鹼基順序互補的mRNA的過程。 細胞生長週期的某個階段，DNA雙螺旋解開以其中一股為轉錄模板，在RNA聚合酶催化下，合成mRNA。mRNA不能自我複製，即其本身不能作為複製模板，因此在轉錄過程中即使出現某
11、些差錯，也不會遺傳下去。,RNA與生物遺傳資訊的表達,首先，DNA透過轉錄作用，將其所攜帶的遺傳資訊（基因）傳遞給 mRNA, 在三種 RNA（mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白質的合成。,轉錄過程,mRNA 是DNA的轉錄本，攜帶有合成蛋白質的全部資訊。蛋白質的生物合成實際上是以mRNA作為模板進行的。,轉譯過程,遺傳密碼,mRNA分子中所存儲的蛋白質合成資訊，是由組成它的四種鹼基（A、G、C和U）以特定順序排列成三個一組的三聯體代表的，即每三個鹼基代表一個氨基酸資訊。 這種代表遺傳資訊的三聯體稱為密碼子，或三聯體密碼子。 因此 mRNA 分子的鹼基順序即表示了所合成蛋白質
12、的氨基酸順序。mRNA的每一個密碼子代表一個氨基酸。20種基本氨基酸的三聯體密碼子都已經確定。此外，還有一個密碼子是 多肽鏈合成起始密碼子, 三個是終止密碼子，以保證蛋白質合成能夠有序地進行。,遺傳密碼,同義碼數個密碼子決定同一個胺基酸，稱為同義碼。終止密碼密碼子UAA、UAG和UGA是終止密碼子，不決定任何胺基酸。起始密碼子AUG為起始密碼子，甲硫胺酸為多肽鏈的起首。,基因與蛋白質合成的關係如何？,2.核糖體(1)組成通常核糖體是由兩個次單元組成，一個較大稱為大次單元，較小的稱小次單元a.兩個次單元組合後方能進行蛋白質合成b.大次單元、小次單元都是由rRNA和蛋白質組成c.蛋白質合成完成後，
13、大、小次單元便分離。,基因與蛋白質合成的關係如何？,多核糖體a.在合成蛋白質時，mRNA是附著在核糖體上。b.若在合成蛋白質的時候，一條mRNA附著許多核糖體，形成一串的核糖體，稱為多核糖體。,基因與蛋白質合成的關係如何？,3.轉送RNA(tRNA)(1)功能在合成蛋白質時，由tRNA攜帶胺基酸，參與合成作用。(2)補密碼 a.每個tRNA的某一部位有三個鹼基組成補密碼與mRNA上的密碼子依鹼基配對原則逐個配對。b.而tRNA的另一端則有特定的胺基酸。,基因與蛋白質合成的關係如何？,tRNA的三級架構,在三葉草型二級架構的基礎上，凸環上未配對的鹼基由於整個分子的扭曲而配成對，目前已知的tRNA
14、的三級架構均為倒L型,(3)參與蛋白質合成的胺基酸a.真核細胞內參與蛋白質合成的胺基酸約有二十個，而mRNA的密碼子有64個，其中有3個為終止密碼子，當作停止轉譯的信號，無tRNA與其結合。b.所以有數個不同補密碼的tRNA可攜帶同種特定胺基酸，例如攜代白胺酸的tRNA有六種，可與UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、CUG等密碼子結合。,基因與蛋白質合成的關係如何？,2.核糖體的P位與A位(1)在核糖體上有兩個位置，一個稱為P位，另一個A位，P位與A位相鄰，在P位的胺基酸與A位的胺基酸藉形成肽鍵而結合(2)當肽鍵形成後，P位的tRNA離開核糖體，而讓A位的tRNA移入,基因與蛋白質合成的關
15、係如何？,3. 肽鍵的形成核糖體沿著mRNA移動，一個個攜帶胺基酸的tRNA前來與mRNA上的鹼基形成配對，前後胺基酸間形成肽鍵相連。4.多肽鏈的形成肽鍵形成後的胺基酸便與mRNA脫離，一個個胺基酸便連結成多 鏈5.終止密碼子當mRNA的停止密碼子出現時，一個多肽鏈便完成合成。,基因與蛋白質合成的關係如何？,蛋白質,蛋白質存在於所有的生物細胞中，是構成生物體最基本的架構物質和功能物質。 蛋白質是生命活動的物質基礎，它參與了幾乎所有的生命活動過程。,Protein,蛋白質的架構組成,蛋白質是一類含氮有機化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、
16、碘、鋅和銅等。這些元素在蛋白質中的組成百分比約為碳 50氫 7氧 23氮 16%硫 03其他 微 量,20種氨基酸,氨基酸的光吸收,構成蛋白質的20種氨基酸在可見光區都沒有光吸收，但在遠紫外區(220nm)均有光吸收。 在近紫外區(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力,幾種重要的不常見氨基酸,在少數蛋白質中分離出一些不常見的氨基酸，通常稱為不常見蛋白質氨基酸。 這些氨基酸都是由相應的基本氨基酸衍生而來的。 其中重要的有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。這些不常見蛋白質氨基酸的架構如下。,一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水
17、形成的鍵結稱為 肽鍵，所形成的化合物稱為多肽 。,多肽的架構,由兩個氨基酸組成的分子稱為雙肽，由多個氨基酸組成的分子則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。,在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸序列 通常在多肽鏈的一端含有一個游離的氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的羧基，稱為羧基端或C-端。 氨基酸的順列是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。如上述五肽可表示為Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,天然存在的重要多,在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質的次單位。 但是，也有許多分子量比較小的多 肽以游離狀態存在。
18、這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽 。 如腦內啡 ；激素類多肽 ；抗生素類多肽 ；谷胱甘肽 ；蛇毒多肽等。,蛋白質的架構,蛋白質是由一條或多條多肽 (polypeptide)鏈以特殊模式結合而成的生物大分子。 蛋白質與多肽並無嚴格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質。 蛋白質分子量變化範圍很大, 從大約6000到1000000道爾頓甚至更大。,蛋白質的一級架構,蛋白質的一級架構(Primary structure)包括組成蛋白質的多肽鏈數目. 多肽鏈的氨基酸順序， 以及多肽鏈內或鏈間雙硫鍵的數目和位置。 其中最重要的是多肽 鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的
19、基礎。,多肽鏈中的各個 平面圍繞同一軸旋轉，形成螺旋架構，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離為0.15nm;鏈內形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個氨基酸殘基的 胺基團的-CO基與第四個氨基酸殘基 胺基團的-NH基形成氫鍵。 蛋白質分子為右手a-螺旋。,（1）-螺旋,-螺旋,（2）-摺疊,-摺疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，透過鏈間的氫鍵交聯而形成的。 鏈的主鏈呈鋸齒樁摺疊構象 在-摺疊中，-碳原子總是處於摺疊的角上，氨基酸的R基團處於摺疊的稜角上並與稜角垂直，兩個氨基酸之間的軸心距為0.35nm；,-摺疊架構的氫鍵主要是由
20、兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一 肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內氫鍵的交聯，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。 -摺疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條 肽鏈的方向相反。,（2）-摺疊,蛋白質的三級架構,蛋白質的三級架構(Tertiary Structure)是指在二級架構基礎上肽鏈的不同區段的側鏈基團相互作用在空間進一步盤繞、摺疊形成的包括主鏈和側鏈構象在內的特徵三維架構。 維系這種特定架構的力主要有氫鍵、疏水鍵、離子鍵和凡德瓦力等。尤其是疏水鍵，在蛋白質三級架構中起著重要作用。,蛋白質的四級架構,蛋白質的四級架構(Quaternary
21、 Structure)是指由多條各自具有一、二、三級架構的肽鏈透過非共價鍵連接起來的架構形式；各個次單元在這些蛋白質中的空間排列模式及次單元之間的相互作用關係。 這種蛋白質分子中，最小的單位通常稱為次單元Subunit，它一般由一條多鏈構成，無生理活性； 維持次單元之間的化學鍵主要是疏水力。 由多個次單元聚集而成的蛋白質常常稱為寡聚蛋白；,四級架構的架構模型,蛋白質電泳,蛋白質在等電點pH條件下，不發生電泳現象。利用蛋白質的電泳現象，可以將蛋白質進行分離純化。,y = -1.1254x + 2.1428 R2 = 0.9949,Coomassie blue strain vs silver s
22、tain To correct the prestained protein ladder,蛋白質膠體溶液的穩定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。 改變溶液的條件，將影響蛋白質的溶解性質 在適當的條件下，蛋白質能夠從溶液中沈澱出來。,蛋白質的沈澱作用,大部分蛋白質均含有帶芳香環的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多數蛋白質在280nm 附近顯示強的吸收。 利用這個性質，可以對蛋白質進行定性鑑定。,蛋白質的紫外吸收,幾種重要的蛋白質類型,1纖維狀蛋白 纖維狀蛋白質(fibrous protein)廣泛地分佈於脊椎和無脊椎動物體內，它是動物
23、體的基本支架和外保護成分， 占脊推展物體內蛋白質總量的一半成一半以上。 這類蛋白質外形呈纖維狀或細棒狀，分子是有規則的線型架構，這與其多肽鏈的有規則二級架構有關，而有規則的線型二級架構是它們的氨基酸順序的規則性反映。,纖維狀蛋白質的類型,纖維狀蛋白質可分為不溶性(硬蛋白)和可溶性二類，前者有角蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白等； 後者有肌球蛋白和纖維蛋白原等，但不包括微管(microtubule)、肌動蛋白細絲(actin filament)或鞭毛( flagella)，它們是球狀蛋白質的長向聚集體(aggregate)。,絲蛋白的架構,絲蛋白是由伸展的 鏈沿纖維軸平行排列成反向b-摺疊架構。分子中不
24、含a-螺旋。絲蛋白的肽鏈通常是由多個六肽單元重複而成。這六肽的氨基酸順序為（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）,(3)肌球蛋白和肌動蛋白,(4)膠原蛋白,膠原蛋白或稱膠原(collagen)是很多脊椎動物和無脊椎動物體內含量最豐富的蛋白質，它也屬於架構蛋白質，使骨、腱、軟骨和皮膚具有機械強度。膠原蛋白至少包括四種類型，稱膠原蛋白I、H、HI和IV。下面主要討論膠原蛋白I。 腱的膠原纖維具有很高的抗張強度(tensile strength)，約為20-30kgmm2， 相當於12號冷拉鋼絲的拉力。 骨骼中的膠原纖維為骨骼提供基質，在它的周遭排列著經磷灰石(hydroxyapatit
25、e)磷酸鈣聚合物Ca10(PO4)6(OH)2結晶。脊椎動物的皮膚含有編織比較疏松，向各個方向伸展的膠原纖維。血管亦含有膠原纖維。,膠原蛋白的架構,膠原蛋白,生物體內膠原蛋白網,2球狀蛋白,球狀蛋白是架構最複雜，功能最多的一類蛋白質。這類蛋白架構緊密，分子的外層多為親水性殘基，能夠發生水化；內部主要為疏水性氨基酸殘基。因此，許多球蛋白分子的表面是親水性的，而內部則是疏水性的。典型的球蛋白是血紅蛋白。 血紅蛋白是一種結合蛋白。血紅蛋白含有四條 鏈，每一條 鏈各與一個血紅素相連接。血紅素同 鏈的連接是血紅素的Fe原子以配價鍵與 鏈分子中的組氨酸咪唑基的氮原子相連。,血紅蛋白,血紅蛋白是脊椎動物紅細
26、胞主要組成部分，它的主要功能是運輸氧和二氧化碳。 血紅蛋白中，血紅素Fe原子的第六配價鍵可以與不同的分子結合無氧存在時，與水結合，生成去氧血紅蛋白(Hb)；有氧存在時，能夠與氧結合形成氧合血紅蛋白(HbO2)。 血紅蛋白與氧的結合不牢固，容易離解。HbO2 的形成和離解受氧的分壓和pH等原素的影響，氧的分壓和pH較高時，有利於血紅蛋白與氧的結合，反之，則有利於離解。,血紅素,血紅素在蛋白中的位置,瓦斯中毒的機製,一氧化碳（CO）也能與血紅素Fe原子結合。由於CO與血紅蛋白結合的能力是O2的200倍，因此，人體吸入少量的CO即可完全抑制血紅蛋白與O2的結合，從而造成缺氧死亡。急救方法是盡快將病患
27、轉移到富含O2的環境中（如新鮮空氣、純氧氣或高壓氧氣），使與血紅素結合的CO被O2置換出來。,免疫球蛋白,免疫球蛋白是一類血漿糖蛋白(serum glycoprotein)。糖蛋白中的蛋白質與糖是共價聯接的。 免疫球蛋白是被脊椎動物作為抗體合成的。它的合成場所是網狀內皮系統的細胞。這些細胞分佈在脾、肝和淋巴節等組織中。 當一類外來的被稱為抗原的物質，如多糖、核酸和蛋白質等侵入機體時即引起抗體的產生，這就是所謂免疫回應。抗體就是免疫球蛋白。,免疫球蛋白的架構,免疫球蛋白G,人的免疫球蛋白可分為五大類，其分子量範圍從150000到950000道爾頓。免疫球蛋白M(IgM)是對一個抗原作出回應時產生
28、的第一個抗體。 免疫球蛋白G(IgG)是一類最簡單的免疫球蛋白。IgG含有兩條相同的高分子量的重鏈(heavy chain)和兩條相同的低分子量的輕鏈(light chain)。 四條鏈透過二硫鍵共價聯接成Y字形架構。每一免疫球蛋白分子含有二個抗原結合部位，它們位於Y形架構的二個頂點。,立體架構模型,Protein Crytallisation,Lysozyme Crystals,40 X,128 X,Lysozyme: 100 mg/ml in 50 mM Na(OAC), pH 4.5 Reagent: 30% w/v MPEG 5000, o.1 M NaCl, 50 mM Na(OAc
29、), pH 4.5,非共價鍵,生物體系中分子識別的過程不僅涉及到化學鍵的形成，而且具有選擇性的識別。共價鍵存在於一個分子或多個分子的原子之間，決定分子的基本架構，是分子識別的一種模式。 而非共價鍵（又稱為次級鍵或分子間力）決定生物大分子和分子複合物的進階架構，在分子識別中起著關鍵的作用。,疏水作用,疏水作用是指極性基團間的靜電力和氫鍵使極性基團傾向於聚集在一起，因而排斥疏水基團，使疏水基團相互聚集所產生的能量效應和熵效應。 蛋白質和酵的表面通常具有極性鏈或區域，這是由構成它們的氨基酸側鏈上的烷基鏈或苯環在空間上相互接近時形成的。 高分子的蛋白質可形成分子內疏水鏈、疏水腔或疏水縫隙，可以穩定生物
30、大分子的進階架構。,基因工程,基因工程是用分離純化或人工合成的DNA在體外與載體DNA結合，成為重組DNA，用以使宿主轉型，篩選出能表達重組DNA的活細胞，加以純化、擴增，成為克隆。也叫分子克隆或重組DNA技術。,基因工程的五個主要步驟,(1)目標基因的取得:從細胞中提取DNA；利用限制酶製備具有黏性末端或平端的目的DNA片斷;用機械方法剪切,如用超音波斷裂DNA;經反轉錄酶製備cDNA,如胰島素基因;用PCR拉出目的基因;,DNA重組技術能從任何基因組內 取出單個片段插入到載體DNA分子如質體中。然後匯入到細菌中進行擴增，每一個被擴增的片段稱為一個DNA克隆（DNA clone）,(2)體外
31、重組,黏性末端連接,如E.coRI GAATTC平端連接,如 HpaI GTTAAC 和機械方法剪切,用接合酶連接;,(3)重組載體導入宿主,轉型(transformation):適合以質體(plasmid)作載體;轉染(transfection):適合噬菌體作載體;轉導(transduction):適合噬菌體作載體;脂質體-介導(liposome-mediated)基因轉移;微注射(microinjection):適合真核細胞;電穿孔(electroporation)法:適合真核細胞;基因槍(biolistics,gene gun):適合植物細胞;,重組質體 轉化細菌 擴增目的 基因,基因槍
32、,用基因槍將 CH-1基因射入胡蘿蔔組織中，使報告基GUS(細菌中的葡糖醛酸酵基因)得到表現,(4)重組體克隆的篩選與鑑定,篩選陽性菌落或噬菌斑a.利用載體的遺傳標記,如抗藥性;b.遺傳互補c.lac-Z顯色回應d.DNA 瓊脂糖電泳鑑定重組體a.菌落或噬菌斑原位分子雜交;b.測序;b.免疫化學和其它產物分析方法.,用膜上原位分子雜交來篩選陽性克隆,細胞基因組,用限制酵剪切,噬菌體,硝酸纖維模,提取DNA,剪切,重組體DNA,雜種噬菌體,細菌,感染,裂解,噬菌斑,菌苔,噬菌斑中的 噬菌體克隆,噬菌體克 隆文庫,膜,X光片,陽性克隆,感染新鮮 的宿主菌,大規模擴增 外源基因,用放射 性探針 與膜
33、溫 育,用放射 自顯影 定位陽 性克隆,11噬菌斑,用IPTG(異丙基硫 代D半乳 糖 浸泡過的膜 覆蓋在平板上),37 溫育,用針標記 膜的位置,從平板上 揭下膜,將膜和1o抗溫育,將膜和I125標 記的2o抗溫育,蛋白質特 異1o抗體,洗膜，乾燥並 用膠片托起膜,將膜放到X 光膠片上,膜,膠片,用主平板校正膠片 並分離陽性克隆,(5)外源基因表達產物的分離提純,電泳管柱層析a.葡聚糖b.親和層析柱,什麼是遺傳工程？,一、什麼叫基因放大？ (一)基因放大原理及技術1.基因放大將含有特定基因DNA的一小片段加以培養，可以大量增加基因數量的方法，稱為基因放大，這種方法是藉聚合酶連鎖回應(PCR)
34、完成。,什麼是遺傳工程？,2.聚合酶的連鎖反應(PCR)的過程(1)藉加熱使DNA兩股多核苷酸鏈分離首先將含有特定基因的一小段DNA加熱至90度，使互相纏繞的DNA兩股多核苷酸鏈分離。(2)冷卻後加入引子a.冷卻後(約至60度)加入引子(primer)。b.引子是人造的數個核苷酸組成的片段，而其鹼基對能與DNA片段的一端互補配對。,什麼是遺傳工程？,(3)第一回聚合作用a.添加DNA聚合酶和核苷酸，在聚合酶的作用下，核苷酸藉鹼基配對，依次在引子上伸展。b.這是第一回的聚合作用，原有的兩股多核 苷酸鏈成為四股。(4)第二回聚合作用重複上述(1)(3)三個步驟，四股多核苷酸鏈變為八股。(5)第三回
35、聚合作用多核苷酸鏈已成為十六股。,什麼是遺傳工程？,什麼是遺傳工程？,3.可製造百萬個相同的基因在試管中重複這種聚合酶的連鎖回應，一天內可將含有特定基因的DNA一小段，製造出百萬片段的DNA，也就是說可製造出百萬個基因。,什麼是遺傳工程？,(二)PCR應用廣泛1.應用領域PCR技術廣泛地應用在許多領域，包含分子生物學、醫學、考古學、刑事及親子監定上。2.分子生物學方面(1)利用PCR技術培養大量DNA用於鹼基序列的分析。就1998年而言，已有十種生物的基因組的鹼基序列已被定出。,什麼是遺傳工程？,(2)美國政府及民間研究機構正在進行人類基因組計畫，將人體二個性染色體及22對體染色體做鹼基序列之
36、定位，估計有三十億個鹼基將被定位，所需大量DNA均藉助PCR技術。,什麼是遺傳工程？,3.刑事方面：當鑑定強暴犯時，藉PCR技術只需一根毛髮、一滴血或一隻精蟲就可製作DNA指紋，用以鑑定強暴犯。4.親子鑑定：PCR亦可用於親子鑑定，鑑定父母與子女關係，PCR反應鑑定親子關係，其準確率可達99.94%。5.其他方面：PCR技術尚可應用於種屬鑑定、性別鑑定以及人類基因的演化。,基因轉殖（Gene transfer）,1.基因瞬間表現(Transient expression)與穩定表現(Stable expression),瞬間表現:外源基因不整合在標的細胞的基因組中，而是以游離的形式存在於標的細
37、胞中。所以，外源基因不能隨著標的細胞基因組的複製而複製。 穩定表現:外源基因以某種形式嵌合在標的細胞的基因組中，隨著標的細胞基因組的複製而複製。,基 因 導 入 的 方 法,基因導入方法: 1)電擊法 (Gene transfer by electroporation),3）農桿菌媒介的基因導入(植物細胞) Transferring genes into plant cells by cointegration using T-DNA，Ti plasmids，and agrobacterium,基因導入方法:,Transfer genes into plant cells by cointeg
38、ration using T-DNA, Ti plasmids, and Agrobacterium.,Regeneration of leaf disks infected by Agrobacterium,4)Liposome-mediated gene transfer（lipofection）,5) Viral vectors(1). SV40 viral vectors,(2).Baculovirous is a very large DNA（genome of about 150kb） that infects insect cells,(3).Use of a retrovirus vector for stable，long-term expression of a foreign gene,
