1、造血干细胞的动员 与归巢 中山大学附属第三医院血液科 范蕊芳 医师,自1993年报道应用基因重组人G-CSF动员正常供者外周血干细胞获得成功后，allo-HSCT在临床上得到广泛应用，并在很大程度上超过骨髓移植成为主要的移植方式。,当进行骨髓动员时，骨髓内的造血干细胞是如何被动员并迁移到外周血？ 经静脉输入受者体内的造血干细胞又是如何定向归巢到骨髓发挥造血重建功能？,造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是具有自我更新及自我复制并向骨髓各系细胞分化能力的细胞。其表面标志随个体发育时期的不同而变化，但都具有共同的表面标志即CD34抗原。,DNA染料标记定位造血干细胞
2、，显示未分化造血干细胞主要是集中于长骨骨小梁区、骨髓腔骨内膜内侧，而分化的造血祖细胞主要分布在骨髓中央区。,干细胞龛(niche)，包括基质细胞、细胞外基质和各种造血因子，主要履行的功能严格指导和控制干细胞的正常活动，干细胞活动的调节可能是由干细胞自身的程序设计进行，也可能是对干细胞龛产生的或外来的各种可溶性因子等刺激物做出的反应，最有可能的是两者均起作用。这些调节作用可以维持干细胞处于休眠、不循环、不分化的状态，也可以决定以哪种方式复制和向哪个种系分化。,造血微环境对于骨髓干细胞的增殖和分化起着至关重要的作用，而骨髓基质细胞是构成骨髓微环境的重要组成部分，基质为造血细胞提供了一个定居、增殖、
3、分化和发育的微环境。在造血干细胞、基质细胞和髓窦内皮细胞及骨髓基质内有一系列黏附分子受体或配体，它们之间的相互作用介导了造血微环境对造血的调节，也影响着造血干细胞的动员。,造血干细胞的动员,早在七、八十年代初，人们发现经化疗或细胞因子刺激后，骨髓干/祖细胞能被释放到外周血中，这一过程被称作“动员”。许多细胞因子如G-CSF、GM-CSF、IL-7、IL-3、IL-12、干细胞因子（SCF）、趋化因子如IL-8、Mip-1、SDF-1和化疗试剂如环磷酰胺（Cy）等具有骨髓动员功能，其中G-CSF和SCF的协同使用能大大提高造血干/祖细胞向外周血的动员，以及移植后造血干/祖细胞的植入。,造血干细胞
4、的归巢,造血干细胞自静脉输人体内，与基质细胞、髓窦内皮细胞及骨髓基质内一系列黏附分子相互作用，并受细胞因子等的调节而植入骨髓干细胞龛(Niche)内，开始执行造血功能，这一过程被称为造血干细胞的归巢。,参与造血干细胞动员与归巢的细胞因子： 一、细胞粘附分子（1）免疫球蛋白家族（2）整合素家族（3）选择素家族 二、趋化因子,细胞黏附分子是一类调节细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互结合、起黏附作用的膜表面糖蛋白，可参与细胞迁徙、锚定、增殖分化和细胞内信号转导的调控。,免疫球蛋白家族,VCAM-1 (vascular cell ad-hesion molecule-1，VCAM-1)广泛分布在造血和
5、非造血细胞表面，包括内皮细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞等，其受体是迟现抗原-4(very late antigen-4，VI A-4)，VCAM-1可选择性地促进单个核细胞的黏附，同时还具有广泛的免疫生物学功能，包括参与调节炎症反应、细胞和组织的分化和发育、免疫应答，以及参与淋巴细胞归巢等。,ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1），是白细胞功能相关抗原-1(1eucocyte unction-associated antigen-1，LFA-1)的诱导配体 ，是在细胞 表面表达的具有介导细胞间或细胞与细胞外基质相互作用的单链跨膜糖蛋白
6、，ICAM-1与LFA-1相互作用与体内抗原的呈递、T淋巴细胞的激活及淋巴细胞与内皮 细胞的黏附、淋巴细胞活化以及归巢过程密切相关。,在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员骨髓造血干细胞的过程中，中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G能够裂解基质细胞表面的VCAM-1分子，下凋基质细胞与造血干细胞之间的黏附作用，实现干细胞的动员。,Kikuta等将5 mgkg的抗VCAM-l抗体及抗VI A-l抗体连续2 d注射入小鼠体内，结果发现其外周血克隆形成细胞(CFCs)和脾集落形成单位(CFU-S)分别较对照组增加11.4倍和21.6倍，而骨髓中的CFCs和CFU-S较对照组明显减少。如果联合G-CSF
7、(125 mgkg，2 d)动员，则CFCs和CFU-S分别较对照组增加141.8倍和439.0倍，提示造血生长因子改变了骨髓基质细胞对造血干细胞的黏附能力，从而达到动员的目的。,VCAM-1可以增强造血干细胞向SDF-1的趋化性及基质金属蛋白酶的分泌，显著提高了NODSCID小鼠移植模型CD34 细胞的归巢。采用抗CD49和VCAM-1抗体可分别阻止造血干细胞归巢于骨髓。,静息状态下VCAM -1、ICAM-l呈低水平表达，且与配体的亲和力较低，在某些环境因素如药物作用下可被快速诱导而迅速上调，斯伐他汀和肿瘤坏死因子受体1能够增强细胞因子诱导的内皮细胞ICAM-1、 VCAM-l的表达。 使
8、用动员剂GCSF后VCAM -1在造血组织的骨髓细胞表达增加，在循环血及体腔中不表达。,整合素家族,整合素家族的黏附分子都是由和两条链通过非共价键连接组成的异源二聚体。 分类：迟现抗原组(1组)、白细胞黏附受体组(2组)、血小板糖蛋白组(3组)、 4组、 5组、 6组、 7组、 8组。,整合素家族中的淋巴细胞功能相关抗原1、迟现抗原4 分别与ICAM-1 、VCAM-1相互作用从而介导造血干/祖细胞与骨髓造血微环境中的各种成分之间的黏附作用。,选择素家族,选择素是一类异亲型结合、Ca2+依赖的细胞粘着分子，能与特异糖基识别并结合。主要参与白细胞与血管内皮细胞之间的识别与粘附。 分类：P- 选择
9、素、E-选择素、 L-选择素。,P-选择素主要集中分布于血小板颗粒和内皮细胞的Webel-Palade小体，当内皮细胞或血小板受到凝血酶、组胺等因子刺激后，P-选择素在几分钟之内就被转运到细胞表面。,E-选择素表达于活化的内皮细胞表面，主要集中在毛细血管后微静脉，内皮细胞受刺激后，E-选择素于4 h表达至高峰，可维持24 h，然后从细胞膜上脱落进入血液，成为可溶性E-选择素。,L-选择素表达于大多数白细胞表面，包括淋巴细胞、中性粒细胞、造血细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞，但主要表达于中性粒细胞。,从人骨髓和胎肝中提取CD34 和CD34细胞，放入有E、P-选择素流动室内，在不同剪切力下流动，发现
10、CD34 细胞在其表面滚动速度明显比CD34一细胞慢，具有显著性差异，并被P-选择素糖蛋白配体1单抗抑制。而CD34一细胞在无E、P-选择素包被表面仍处流动状态。,将人的CD34 细胞移植到缺乏P-选择素、E-选择素的NODSCID小鼠体内，发现CD34 细胞在内皮细胞上的滚动以及在骨髓龛中的滞留均明显减少(减少量90)。,趋化因子,SDF-1属CXC型趋化因子，主要表达在骨髓基质细胞、骨髓内皮细胞以及CD34+CD38+造血祖细胞。同时表达于多种组织，比如皮肤、肝胆管的上皮细胞、大脑内皮细胞和心肌。 一定的SDF-1浓度梯度维持了干细胞池的稳态。,当用G-CSF动员外周血时，各种蛋白水解酶不
11、仅对胞外基质进行切割，还能切割SDF-1并使其失活。 在进行骨髓动员的鼠中，骨髓SDF-1的浓度会下降，这种结果直接导致体内丝氨酸蛋白酶的积累，后者直接切割SDF-1导致其失活。,SDF-1的受体CXCR4是一个有七个跨膜结构域的G蛋白耦联的受体。在CD34+造血干细胞/祖细胞表面都有广泛表达。,SDF-1CXCR4是目前明确的对造血干细胞趋化归巢起最重要作用的分子。人的骨髓内皮细胞连续表达SDF-1 ，其通过结合CD34+细胞表面的CXCR4而捕获造血干/祖细胞。,在黏附分子LFA-1/ICAM-1 和VLA-4/VCAM-1的参与下，造血干/祖细胞与内皮细胞产生黏附。内皮细胞表面表达的SD
12、F-1不仅能捕获迁移中的造血干/祖细胞，同时能通过CXCR4介导的细胞反应，如上调黏附分子的表达，激活干/祖细胞穿越内皮细胞层的迁移运动。,CD34 造血干细胞可依据SDF-1的浓度梯度迁移，并且SDF-1在诱导造血干细胞趋化和转移动员的同时，也具有刺激活性，增加造血干细胞的增殖分化。,SCF、IL-6能诱导CXCR4在CD34+上的表达 C3aR- C3a的作用提高了SDF-1对CXCR4的识别敏感作用 CD26具有切割SDF的功能,SDF-1与CXCR4信号传导通路示意图,造血干细胞与基质细胞间的粘附作用减弱,Ca,破骨细胞,细胞外基质的降解,造血干细胞的移行、渗出,造血干细胞归巢过程,小结,造血干细胞的动员和归巢是多种细胞粘附分子、细胞因子和趋化因子共同作用的结果，其中SDF-1CXCR4轴在介导造血干细胞粘附、迁徙、趋附、定居方面起关键作用是。应激、损伤、缺氧及G-CSF等均可诱导损伤局部SDF-1大量表达，从而捕获循环中的HSCs归巢于损伤局部，进而增殖分化为各种功能细胞。,谢谢大家！,
