1、食品微生物检验用样品的抽样方法及应用,食品抽样检测的概念和目的,抽样（sampling） 抽取样品或组样的程序。基于统计方法的抽样程序用于对检验批作出判断。 （可接收性抽样： 从某批中选择一个或多个样品进行检验,根据样品检验结果对该批予以接受或者不接受。）目的：有代表性地，能客观、真实地反映整批产品的卫生质量。,如果样品的采取、运送、保存或制备过程中操作不当，或者样品不具有代表性，就会使实验室的微生物检验结果毫无意义。微生物检验采样的核心要求： 1 保证样品的代表性和一致性 2 保证整个微生物检验过程在无菌操作条件下完成,食品抽样检测的意义,1. 及时掌握食品及原料的过程卫生状况（食品采购、生
2、产加工、储存运输、销售消费等）2. 评价食品卫生质量3. 用于寻找及分析问题，制定和实施控制措施抽样检测足够量的样品以获得同一批次产品的有意义的信息。一个合理的抽样计划并不能保证健康危害完全不发生。,国际食品和饲料微生物抽样依据,国际食品微生物标准委员会 (International Committee on Microbiological Specification for Foods, ICMSF) 美国食品药品管理局(USA FDA) 美国农业部(USDA) 欧盟委员会法令(EC) 新西兰食品安全局(NZFSA) 澳大利亚检验检疫局(AQIS),我国食品和饲料微生物抽样依据,国家标准（G
3、B,GB/T）农业部行业标准（绿色食品，无公害食品等）（NY，NY/T）检验检疫行业标准（SN，SN/T）地方标准（DB）,抽样方案,抽样方案不是孤立存在的，它应与产品卫生标准和方法标准等充分衔接，才能有效。,卫生标准,抽样方案,检验方法,食品安全目标FSO,ICMSF计数抽样方案的设定,考虑的因素： 检验目的 产品及被抽样品的性质 分析方法 设定根据： 1）各种微生物本身对人的危害程度各有不同 2）食品经/不同条件处理后，其危害度变化情况的降低/不变增加来设定抽样方案并规定其不同采样数。,风险分类矩阵,完整的抽样方案,受关注的或具重要性的微生物或微生物组别有待测试的样本数目（n）测试方法微生
4、物含量限值，m及M 可接收（ m） 仅可接收（介乎m与M之间） 不可接收（M）每类微生物含量限制（即可接收/仅可接收/不可接收）的样本数目。香港食物环境卫生署 即食食品微生物含量指引,ICMSF推荐的随机抽样方案,食品微生物2 微生物检验的抽样原理及特殊应用（1986，第2版）随机抽样随意抽样 从N个单位产品的一个批次抽取n个样品，此n个样品的任何组合方式均具有相同的被抽取概率。（随机号码表） 采用何种抽样方式主要依赖于对食品中微生物情况的认识程度。需将微生物的危害度、食品特性及处理条件三者结合在一起对食品微生物进行安全性评价 。,组批和抽样,一批指在同一条件下生产或处理的一定数量的食品。组批
5、规则参见各产品标准抽样量：指从全批产品（或全过程）中抽取的单位包装检样量：指检验用量，是抽样量各包装的混合样品的一部分抽样量检验量,样品采集、运送、检验和处理过程中的质量保证,采样前准备：采样工具与容器。,大容器内手工混匀的用具（ISO 8262：2001milk and milk products-general guidance for preparation of test samples.),多层取样器,样品容器,对取样工具和一些试剂材料应提前准备、灭菌开启容器的工具：双层纸包裹灭菌（121，15min）后，通常可在干燥洁净的环境中保存2个月。超过2个月后要重新灭菌。样品采集工具。取样
6、容器：采用密封容器，最好不要使用玻璃容器，因为其在运输途中易破碎而造成取样失败。温度计、标记工具、防护用品等。,样品采集、运输和贮存： 运输工具的容量应足以放下所取的样品。采样及运输过程符合要求的时间和温度，防止污染和变质。预处理、分析检验：适宜环境、正确的制样和测试方法,制样的一般要求,全部制备过程应为无菌操作冷冻样品应在规定温度和时间下缓化制样应充分均匀： 液体样品振摇混匀；粉末状的边取边混；固体样品应从不同部位取样，兼顾表面和深度。取好的样品应以适宜方式与稀释液充分混匀尽量去除产品中可能存在的影响微生物指标检测的因素,微生物检验抽、制样操作原则,防污染 防止抽样、制样及检测的各个环节引入
7、外源污染；或使样品污染人员及环境均匀与合理 尽量了解目标微生物在产品中的浓度和分布 ，兼顾检样的代表性和偶然性,抽样方案的选择,广泛分布于食品中，具有严重危害或者中度健康危害的微生物（病原菌），如沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌、肉毒梭菌、单核细胞增生李斯特菌等 执行二级计数抽样方案（+/-）,没有或者具低度危害的微生物（卫生指标菌），或者具中度危害（扩散限制）的微生物，如需氧微生物、嗜冷微生物、乳酸菌、酵母菌、霉菌（产犊霉菌除外）、大肠菌群、耐热大肠菌群等 执行三级计数抽样方案（数值和浓度）,二级计数抽样方案流程,目标微生物以检出/未检出（+/-）为指标： 设定m值、n值和c值 抽取n
8、个子样，组成试验样品 检验每个子样 所有样品的检验结果m,或 c个样品的检验结 果 m，接收该批次 c个样品的检验结果m，拒绝接收该批次 举例：,例1：鸡肉中沙门氏菌标准为为n=5、c=0、m=0 。其中n=5即取样5个，c=0即意味着在该批检样中，未检测到沙门氏菌，则此批货物可被接受。例2：生食海产品鱼的副溶血弧菌标准为n=5、c=0、m=102 。其中n=5即取样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有菌落数超过m值的检样，此批货物可被接受。,三级计数抽样方案流程,目标微生物以计数为指标： 设定m值、M值、n值和c值 抽取n个子样，组成试验样品 检验每个子样 所有样品的检验结果 m，或c
9、个样品的检验结果介于 m和M之间；接收该批次 c个样品的检验结果介于m和M之间，或所有样品的检验结果M；拒绝接收该批次 举例：,例： 冷冻生虾的细菌总数标准n=5、c=3、m=101、M=102。其意义是从一批产品中，取出5个检样，检样结果允许3个检样的菌落数在m和M值之间。如果有3个以上检样的菌落数是在m和M值之间或1个检样菌落数超过M值者，则判定该批产品为不可接受。,各种微生物本身对人的危害程度各有不同。 食品经不同条件处理后，其危害度变化情况分为三种情况，即降低危害度、危害度未变或危害度增加，根据食品危害度的变化情况来确定取样方案，并规定其不同取样数。,涉及健康危害水平的抽样方案及其应用
10、条件ICMSF,举例1,巴氏灭菌的液态、冷冻、干燥鸡蛋制品的抽样方案（ICSMF，1986）,GB2749-2003蛋制品卫生标准,主要采用二级取样方案：中国、以色列、日本、美国、南非、古巴等 主要采用三级取样方案：中国、智利、新西兰、欧洲委员会、加拿大、芬兰、丹麦、法国、澳大利亚等 从标准的严格程度看，二级取样方案比三级取样方案要求更严格。二级取样方案的合格判定标准只有“是”和“否”，没有中间带，而三级取样方案则有中间带，相对宽松，这也表明三级取样方案更注重各种微生物本身对人的危害程度，从风险评估的角度看，也更科学一些。从标准的制定来看，三级取样方案判定合格标准的制定更需建立在科学评估的基础
11、上，手续更加繁琐，而且在实际应用中操作较复杂；而二级取样方案在实际操作中则相对简单。,GB4789.1-2010,4.2 采样方案4.2.1类型 采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、c和m值，三级采样方案设有n、c、m和 M值。 n：同一批次产品应采集的样品件数； c：最大可允许超出m值的样品数； m：微生物指标可接受水平的限量值； M： 微生物指标的最高安全限量值。 注1： 按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许有c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。 注2： 按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值；允 许有c个样
12、品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。,GB4789.1-2010,例如：n=5，c=2，m=100 CFU/g，M=1 000 CFU/g。含义是从一批产品中采集5个样品，若5个样品的检验结果均小于或等于m值（100 CFU/g），则这种情况是允许的；若2个样品的结果（X）位于 m值和M值之间（100 CFU/g 1 000 CFU/g）， 则这种情况也是不允许的。 4.2.2 各类食品的采样方案 按相应产品标准中的规定执行。,采用二级和三级取样方案的食品安全国家标准2010,GB5420干酪GB11674乳清粉和乳清蛋白粉GB19302发酵乳G
13、B19644乳粉GB19645巴氏杀菌乳GB25191调制乳GB25192再制干酪GB13102炼乳GB 19646稀奶油、奶油和无水奶油2010-12-01实施,GB10765婴儿配方食品GB10767较大婴幼儿和幼儿配方食品GB10769婴儿谷物类辅助食品2011-04-11实施（GB19301生乳2010-06-01实施，未采用二级或三级取样方案）,抽样检验的局限,低水平污染的微生物检出概率低微生物分布的不均匀性对检出概率有影响不均匀性未知受检验方法的质量限制,用作控制危害的工具，使受控，而非检查应根据需要增减频率,生产和加工环境的微生物采样,“环境” 与产品接触表面或其他可能存在的污染
14、环节，如生产加工设备和材料、加工环境和操作人员。卫生标准操作程序(SSOP)中的“食品接触表面”生产环境与环节中的间接接触, “环境接触表面”如空气气溶胶，地板，排水渠，墙壁，高架结构，设备，围裙，卡车或汽车轮子。,此类采样监测一般不宜复检，结果适用于加工环境卫生状况的趋势性分析、评估与控制。对某一致病菌的环境监测采样同样适用，需要参考致病菌检测的具体方法要求。,擦拭法原理,选定一定范围的产品接触表面/环境，用干或湿的棉签进行擦拭，然后将棉签浸入灭菌稀释液或中和液的容器中，混匀后进行检测。,材料与器具,样品采集工具：单独包装的灭菌的棉签、海绵、纱棉垫等。海绵和纱棉垫用于100cm2的表面采样。
15、取样工具必须符合无菌要求。取样容器：灭菌的瓶或袋，试管及其他类似的密闭容器。最好不要使用玻璃容器。消毒剂：75%酒精或其他有类似效果的食品级消毒剂。,稀释液：灭菌的缓冲蛋白胨水（0.1%，PH7.5）或含盐蛋白胨水以及其他适当的稀释液（如M肉汤、LB肉汤、D/E中和肉汤、脑心浸液肉汤等）。标记工具样品运输工具：便携式冰箱或保温箱。使用保温箱或替代容器（泡沫塑料箱）时，应将足够量的冷冻冰袋放在容器的四周，以保证运输过程中样品容器的温度。防护用品：经消毒灭菌的工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。,操作步骤,棉签采样： (1)台面： 取出棉签，在含稀释液的管中润湿，在管壁上挤去多余的水分。手捏棉签棒
16、，用棉签头在选定的区域（20cm2-100cm2）内用力擦拭。具体的方式是先水平再垂直地移动，并转动拭子，使其所有面都用到。折断或切除手接触部分棉签棒，将棉签头放入含稀释液的试管内，密闭。,棉签采样：(2)人手 : 取出棉签，在含稀释液的管中润湿，在管壁上挤去多余的水分。请被检人五指并拢，用棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，折断或切除手接触部分棉签棒，将棉签头放入含稀释液的试管内，密闭。,结果表达,计数初始稀释液中每毫升的菌落数，然后按公式计算每平方厘米接触面上的菌落数（Ns）。 NF Ns= D A 其中N为1mL稀释液（或中和液）中的菌落数；F为试管或均质袋内稀释液（或中和液）
17、的总体积，以mL表示；A为被测接触面的面积，以cm2表示；D为稀释倍数。,样品传递,采集完毕的样品应保存在1-4的保温箱中，并在4h内送达检测实验室。实验室应在24h内进行检测。,空气采样与测试方法-1沉降法,样品采集 在动态下进行。室内面积不超过30m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙lm;室内面积超过30m2,设东、西、南、北、中5点，周围4点距墙1m.采样时，将含营养琼脂培养基的平板(直径9cm)置采样点(约桌面高度)，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5 min。,细菌培养 在采样前将准备好的营养琼脂培养基置35 士2 培养24h ，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。 将 已采 集 的培养基在6h内送实验室，于35 士2 培养48h 观察结果，计数平板上细菌菌落数。,菌落计算 Y1=50000*A/S*T式中:Y1-空气中细菌菌落总数,cfu/m3A-平板上平均细菌菌落数cfuS-平板面积，cm2T-暴露时间，min,一次性使用卫生用品卫生标准GB15979-2002,生产环境卫生指标 装配与包装车间空气中细菌菌落总数应2500cfu/m3 工作台表面细菌菌落总数应20cfu/cm2 工人手表面细菌菌落总数应300cfu/只手，并 不得检出致病菌。,谢 谢 各 位！,
