piggyBac转座系统的功能改进及在哺乳动物中的应用.docx

1、遗 传 Hereditas (Beijing) 2014 年 10 月 , 36(10): 965 综 述piggyBac 转 座 系 统 的 功 能 改 进 及 在 哺 乳 动 物 中 的 应 用钱秋杰，车家倩，叶露鹏，钟伯雄浙 江 大 学 动 物 科 学 学 院 ， 杭 州 310058摘 要 : piggyBac (PB)转 座 系 统 具 有 转 座 效 率 高 、 删 除 精 确 、 半 随 机 插 入 和 携 带 片 段 较 大 等 优 点 。 但 是 作 为 一 种 转 基 因 实 验 的 工 具 ， 特 别 是 在 哺 乳 动 物 个 体 水 平 的 转 基 因 方 面 ，

2、还 需 要 提 高 其 转 基 因 效 率 ， 并 降 低 外 源 基 因 随 机 插 入 对 内 源 基 因 破 坏 的 风 险 。 近 年 来 的 研 究 结 果 显 示 ， PB 转 座 系 统 得 到 了 进 一 步 改 进 ： 采 用 PB 转 座 酶 与 DNA 特 异 性 结 合 蛋 白 融 合 而 构 成 的 融 合 型 转 座 酶 ， 表 现 出 外 源 片 段 有 插 入 到 染 色 体 靶 向 位 点 的 倾 向 ； 采 用 突 变 体 筛 选 的 方 法 提 高 了 PB 转 座 酶 的 活 性 ， 获 得 了 只 具 有 切 除 活 性 而 没 有 插 入 活 性 的

3、 新 型 PB 转 座 酶 ； 采 用 PB转 座 系 统 与 细 菌 人 工 染 色 体 (Bacterial artificial chromosomes, BAC)载 体 联 合 使 携 带 的 外 源 片 段 长 度 提 高 到 了 207 kb。改进后的 PB 转 座 系 统 在 基 因 组 研 究 、 基 因 治 疗 、 诱 导 多 能 干 细 胞 (Induced pluripotent stem cells, iPSCs) 诱 导 及 其 分 化 方 面 发 挥 了 较 大 的 作 用 。 文 章 对 PB 转 座 系 统 的 最 新 研 究 进 展 和 应 用 前 景 进 行

4、 了 综 述 。关 键 词 : piggyBac； 转 基 因 ； 靶 向 插 入 ； 转 座The improvement and application of piggyBac transposon system in mammalsQiujie Qian, Jiaqian Che, Lupeng Ye, Boxiong ZhongCollege of Animal Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, ChinaAbstract: The piggyBac (PB) transposon system is a useful gen

5、omic engineering tool due to its high transposition efficiency, precise excision, semi-random insertion and large cargo capacity. But, it still needs to further improve the transgenic efficiency and reduce the risk of endogenous disruption caused by the random insertion of exogenous gene, especially

6、 in transgenic experiments of individual mammals. In recent studies, the PB transposase is fused with a DNA binding protein as a chimeric protein, which can guide the transposon to pre-designed loci. Besides, PB trans- posases obtained by mutagenesis have dramatically enhanced transposition activity

7、 and generated a novel function which is excision competent and integration defective. Furthermore, PB transposon system can carry large exogenous DNA fragments up to 207 kb when combining with the bacterial artificial chromosome vector. So far, these modified transposon systems have been widely app

8、lied in genome studies, gene therapy and induced pluripotent stem cells (iPS cells). In this study, we review the latest studies on piggyBac transposon system and its application prospect.Keywords: piggyBac; transgene; target insertion; transposition收 稿 日 期 : 2014-05-27; 修 回 日 期 : 2014-08-29基 金 项 目

9、: 国 家 重 点 基 础 研 究 发 展 计 划 (973 计 划 )项 目 (编 号 ： 2012CB114601)和 浙 江 省 科 技 厅 项 目 (编 号 ： 2013C32048)资 助作 者 简 介 : 钱 秋 杰 ， 硕 士 研 究 生 ， 专 业 方 向 ： 转 基 因 家 蚕 丝 腺 生 物 反 应 器 。 E-mail: 通 讯 作 者 : 钟 伯 雄 ， 教 授 ， 博 士 生 导 师 ， 研 究 方 向 ： 家 蚕 分 子 生 物 学 。 E-mail: DOI: 10.3724/SP.J.1005.2014.0965网 络 出 版 时 间 : 2014-9-17

10、17:23:03URL: http:/ 座 子 (Transposon)又 称 跳 跃 基 因 ， 是 能 够 在 基 因 组 上 移 动 的 DNA 片 段 ， 由 美 国 女 科 学 家 Barbara McClintock 最 早 在 1951 年 提 出 1， 并 因 此 在 1983 年获得诺贝尔医学及生理学奖。转座子分为 DNA 转 座 子 (DNA transposon) 和 逆 转 录 转 座 子 (Retrotran- sposon)两 大 类 ， 前 者 以 “剪 切 粘 贴 ”(cut-paste)的 方 式 将 DNA 片 段 从 原 始 基 因 位 点 转 移 到 新

11、 的 基 因 位 点 ， 后 者 是 将 RNA 经 逆 转 录 酶 反 转 录 成 DNA 后 再 插 入 到 新 的 基 因 位 点 。 大 量 的 物 种 基 因 组 测 序 结 果 发 现 ， 转 座 子 在 生 物 进 化 过 程 中 具 有 重 要 作 用 2。 转 座 子 在 哺 乳 动 物 中 的 应 用 得 益 于 由 鱼 类 改 造 而 来 的 “睡 美 人 ”转 座 子 (Sleeping Beauty)的 应 用 3， 由 此 掀 起 了 哺 乳 动 物 利 用 转 座 子 系 统 的 研 究 热 潮 46。 但 是 “睡 美 人 ”转 座 子 存 在 过 量 抑 制

12、效 应 和 携 带 片 段 偏 小 (5 kb 左 右 )等 缺 陷 7,8， 使 其 在 转 基 因 应 用 上 受 到 限 制 。piggyBac(PB)转 座 子 首 次 在 鳞 翅 目 昆 虫 粉 纹 夜 蛾 (Trichoplusia ni)细 胞 系 TN-368 中 发 现 9。 之 后 ， 在 地 中 海 果 蝇 (Ceratitis capitata)、 黑 腹 果 蝇 (Dro- sophila melanogaster)、 埃 及 伊 蚊 (Aedes aegypti)和 家 蚕 (Bombyx mori L.)等 昆 虫 中 利 用 PB 转 座 系 统 均 取 得 了

13、 转 基 因 实 验 的 成 功 1013。 研 究 证 明 PB 转 座 子 是 一 个 广 谱 的 转 座 系 统 ， 可 以 在 多 种 生 物 中 实 现 转 座，其中包括酵母(Schizosaccharomyces pombe)14,15、 真 涡 虫 (Girardia tigrina)16、斑马鱼(Danio r erio)17、 鸡 18、 牛 19,20、 猪 21,22和 水 稻 23等 等 。PB 转 座 子 系 统 是 以 “剪 切 粘 贴 ”机 制 进 行 转 座 ， 即 转 座 酶 切 割 PB 转 座 子 两 端 反 向 重 复 序 列 (Inverse term

14、inator repeats, ITR)末 端 的 TTAA 序 列 ， 将 转 座 子 从 原 始 基 因 座 切 下 来 ， 然 后 插 入 到 基 因 组 新 的 TTAA 位 点 上 。 最 早 应 用 于 转 基 因 实 验 的 PB 转 座 系 统 是 二 元 系 统 24， 即 采 用 外 源 基 因 替 换 PB 转 座 子 的 转 座 酶 基 因 ， 把 转 座 酶 基 因 构 建 到 另 一 个 两 端 没 有 ITR 或 ITR 被 破 坏 了 的 表 达 质 粒 中 。 近 年 来 也 有 实 验 应 用 一 元 系 统 ， 即 将 转 座 酶 基 因 序 列 调 整

15、到 同 一 质 粒 的 PB 转 座 子 ITR 序 列 的 外 侧 25。 这 两 种 系 统 都 能 使 转 座 片 段 和 转 座 酶 基 因 在 转 座 后 成 功 分 离 ， 实 现 转 座 片 段 插 入 基 因 组 后 不 再 转 座 ， 达 到 稳 定 遗 传 的 目 的 。PB 转 座 系 统 具 有 多 方 面 的 优 势 ， 转 座 效 率 高 26是 PB 转 座 系 统 能 够 被 普 遍 应 用 于 转 基 因 实 验 的 重 要原因之一。能够携带较大的外源 DNA 片 段 的 能 力 是 该 系 统 的 另 一 个 优 点 ， 当 转 座 片 段 在 14 kb

16、以 内 时 ， 转 座 效 率 不 会 显 著 下 降 26,27。 PB 转 座 系 统 还 具 有 半 随 机 (semi-random)插 入 的 特 点 ， 即 转 座 片 段 具 有 插 入 到 转 录 起 始 位 点 上 下 游 附 近 以 及 基 因 内 含 子 区 域 处 的 TTAA 位 点 的 偏 好 性 28， 这 使 得 PB 系 统 有 利 于 癌 基 因 捕 获 和 增 强 子 捕 获 29,30。 PB 转座系统在 转座片段被切除后不会在原位点留下印迹(footprint)， 基 因 组 可 以 实 现 切 除 后 精 确 修 复 31,32， 在 可 逆 转 基

17、 因 的 应 用 中 具 有 重 要 作 用 。 PB 转 座 酶 可 塑 性 高 ， 通 过 与 其 它 功 能 蛋 白 融 合 或 改 变 转 座 酶 的 功 能 区 域 ， 不 仅 能 够 改 变 转 座 酶 的 活 性 和 作 用 方 式 ， 也 可 以 提 高 外 源 基 因 转 座 的 靶 向 性 3335。PB 转 座 系 统 在 哺 乳 动 物 中 同 样 也 具 有 高 效 转 座 活 性 26以 及 其 他 特 性 ， 使 得 该 系 统 在 基 因 组 研 究 、 基 因 治 疗 、 干 细 胞 诱 导 和 诱 导 后 分 化 等 研 究 领 域 获 得 了 广 泛 的

18、应 用 33,3644。1 piggyBac 转 座 子 的 转 座 机 制PB 转 座 子 5端 和 3端 各 有 一 个 不 对 称 的 末 端 重 复 结 构 域 (Terminal repeat domain, TRD)， 即 都 包 含 13 bp 和 19 bp 的 反 向 末 端 重 复 序 列 ， 不 同 的 是 5端 和 3端 的 间 隔 序 列 分 别 为 3 bp 和 31 bp， 中 间 是 2374 bp 的 内 部 结 构 域 (Internal domain, ID)45,46。 PB 转 座 酶 在 转 座 片 段 末 端 TTAA 与 GGG 之 间 的 T-

19、G 进 行 单 链 切 割 (nick)， 产 生 3-OH； 通 过 3-OH 攻 击 互 补 链 的 TTAA 形成短暂的发卡结构 (hairpin)，将转 座 片 段 从 基 因 组 上 切 割 出 来 ； 形 成 发 卡 结 构 的 转 座 片 段 在 转 座 酶 的 作 用 下 ， 再 次 被 单 切 ， 产 生 TTAA 的 粘 性 末 端 ； 最 后 ， 又 以 3-OH 进 攻 靶 位 点 的 TTAA， 将 目 的 基 因 插 入 到 靶 位 点 47。 但 是 将 5和 3端 TRD 同 时 都 用 3端 TRD 或 5端 TRD 代 替 时 ， 并 不 能 产 生 转 座

20、 现 象 38， 这 说 明 转 座 酶 在 将 目 的 片 段 转 座 到 新 的 基 因 位 点 时 需 要 左 右 臂 相 互 配 合 。 在 供 体 质 粒 转 座 到 受 体 质 粒 实 验 中 ， PB 转 座 臂 需 要 的 最 短 ID 序 列 是 55 bp48，而在供体质粒转座到受体基因组实 验 中 ， 5和 3端 最 短 ID 序 列 长 度 组 合 分 别 为 311 bp 和 235 bp49或 333 bp 和 179 bp50，暗示转座臂与转 座 酶 之 间 的 亲 和 力 会 影 响 PB 转 座 系 统 的 转 座 效 率 。酶 的 功 能 是 由 结 构 域

21、 的 结 构 决 定 的 。 以 转 座 的 方 式 来 看 ， PB 转 座 酶 应 该 至 少 包 含 结 合 结 构 域 (Binding domain)、 催 化 结 构 域 (Catalytic domain)和 核 定 位 信 号 (Nuclear localization signals)， 可 能 还 存 在 转 座 酶 之 间 作 用 的 功 能 域 。 已 有 研 究 表 明 ， PB 转 座 酶 的 核 定 位 信 号 存 在 于 转 座 酶 C 端 第 551571 氨 基酸之间 51。DDE 重 组 酶 具 有 结 合 镁 离 子 的 催 化 核 心 域 DDE 结

22、构 域 ， 而 结 构 预 测 和 突 变 筛 选 都 显 示 PB 转 座 酶 的 第 268、 346、 447 个 天 冬 氨 酸 (D)也 具 有 类 似 DDE 结 构 域 的 功 能 47,52， 该 结 构 域 附 近 的 其 他 保 守 氨 基 酸 与 转 座 酶 的 切 割 和 插 入 功 能 有 关 ， 将 第 372 位 精 氨 酸 残 基 与 第 375 位 赖 氨 酸 残 基 突 变 成 丙 氨 酸 后 ， 获 得 的 PB 转 座 酶 只 有 剪 切 功 能 而 丧 失 了 插 入 功 能 53。 通 过 氨 基 酸 序 列 比 较 发 现 ， PB 转 座 酶 存

23、 在 几 个 氨 基 酸 保 守 性 比 较 丰 富 的 区 域 52， 这 些 保 守 区 域 很 可 能 是 转 座 酶 的 功 能 区 域 。 用 染 色 质 免 疫 沉 淀 实 验 (Chromatin immunoprecipitation, ChIP)证 实 PB 转 座 酶 在 无 转 座 臂 的 情 况 下 ， 也 可 以 结 合 到 TTAA 序 列 35。 以 上 研 究 结 果 表 明 ， PB 转 座 酶 具 有 多 个 功 能 结 构 域 ， 深 入 地 理 解 转 座 酶 的 这 些 结 构 域 在转座功能上的作用，将有利于对 PB 转 座 酶 进 行 改 造，提高

24、转座酶的转座活性，改善靶向转座的能力。2 piggyBac 转 座 子 转 座 效 率 的 改 善转 基 因 效 率 是 影 响 转 座 子 系 统 在 基 因 组 研 究 、 哺 乳 动 物 转 基 因 、 基 因 治 疗 等 领 域 应 用 的 关 键 因 素 。 病 毒 载 体 因 其 插 入 效 率 高 而 广 泛 应 用 于 前 期 的 哺 乳 动 物 转 基 因 研 究 中 ， 但 是 因 为 其 携 带 片 段 小 、 易 引 起 癌 变 、 外 源 基 因 易 沉 默 等 缺 陷 ， 使 得 该 系 统 在 应 用上受到了限制。PB 转 座 系 统 已 经 被 证 明 能 够

25、在 人 HEK 293 细 胞 和 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 中 ， 将 外 源 基 因 转 座 到 宿 主 基 因 组 内 ， 转 基 因 效 率 较 高 ， 转 基 因 阳 性 细 胞 数 /转 染 前 细 胞 总 数 的 比 率 约 为 10426。在小鼠胚胎干细胞中，将昆虫源 PB 转 座 酶 的 基 因 序 列 密 码 子 优 化 成 小 鼠 偏 好 的 密 码 子 ， 可 以 使 转 座 效 率 提 高 20 倍 36,38；在人胚胎干细胞实验中，PB 转 座 酶 基 因 经 密 码 子 优 化 后 ， 转 座 效 率 提 高 了 10 倍 左 右 ， 使 转 基 因 阳 性 率

26、 达 到 5%左右，把 5端 转 座 臂 的 反 向 末 端 重 复 序 列 ITR 的 第 53 位 碱 基 T 转 换 为 C(T53C)， 第 136 位 的 碱 基 C 转 换 为 T(C136T)， 不仅 能 够 使 转 座 效 率 进 一 步 提 高 59%， 而 且 能 够 使 携 带 的 转 座 片 段 长 度 增 加 到 18 kb36，为插入大片段外 源基因提供了有效方法。对密码子优化后的 PB 转 座 酶 基 因 序 列 随 机 突 变 后 ， 在 酵 母 中 筛 选 到 18 个 极 度 活 跃 的 PB 转 座 酶 突 变 体 ， 其 中 的 5 个 突 变 体 (I

27、30V/G165S 、 S103P 、 M282V 、 S509G/N570S 和N538K)被 证 实 在 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 中 也 具 有 相 似 或 更 高 的 转 座 效 率 ， 并 且 进 一 步 通 过 突 变 体 之 间 的 组 合 找 到 了 一 个 7 个 氨 基 酸 发 生 突 变 、 转 座 活 性 最 高 的 突 变 体 hyperactive piggyBac(mPB7)， 其 插 入 活 性 和 切 除 活 性 比 突 变 前 的 转 座 酶 分 别 提 高 了 9 倍 和 17 倍 54。 将 昆 虫 源 PB 转 座 酶 (iPB)突 变 了 7 个

28、氨 基 酸 残 基 的 PB 转 座 酶 (iPB7)， 与 密 码 子 优 化 的 PB 转 座 酶(mPB)相比，不仅在人肝细胞(Huh-7 cell)中 的 转 基 因 效 率 提 高 了 2 倍 ， 使 阳 性 细 胞 数 占 转 染 前 细 胞 总 数 的 0.22%左 右 ， 而 且 能 够 使 外 源 基 因 在 小 鼠 肝 脏 内 的 表 达 量 也 增 加 2 倍 55。 在 HEK293 细 胞 中 直 接 比 较 iPB、 iPB7、 mPB 和 mPB7 4 个 PB 转 座 酶 发 现 ， 经 密 码 子 优 化 后 的 PB 转 座 酶 表 达 量 比 不 经 密

29、码 子 优 化 的 转 座 酶 高 出 10 倍 ， 同 时 也 发 现 PB7 转 座 酶 在 低 剂 量 情 况 下 相 对 于 突 变 前 的 PB 转 座 酶 转 座 效 率 优 势 更 加 明 显 56。 但 是 ， iPB7 转 座 酶 在 果 蝇 和 埃 及 伊 蚊 中 转 座 效 果 并 不 令 人 满 意 ， 虽 然 iPB7 在 果 蝇 细 胞 中 转 基 因 效 率 达 到 了 3.14103， 相 对 于 原 始 PB 转 座 效 率 (1.14103)有 所 提 高 ， 但 是 在 个 体 水 平 转 基 因 实 验 中 ， iPB7 转 座 酶 导 致 80%左 右

30、 的 果 蝇 发 生 了 不 育 的 现 象 57。PB 转 座 酶 末 端 与 某 些 外 源 肽 段 连 接 后 的 融 合 蛋 白 也 能 提 高 PB 转 座 系 统 的 转 座 效 率 。 GFP、 His tag、 Myc tag 和 HIV-TAT(HIV-1 transactivator of tran- scription protein)通 过 不 同 的 组 合 与 PB 转 座 酶 融 合 后 获 得 了 两 个 重 组 转 座 酶 TPLGMH 和 ThyPLGMH， 在 人 HEK293 细 胞 的 转 基 因 实 验 中 转 座 效 率 比 Myc-tagged

31、PB 转 座 酶 分 别 提 高 了 9 倍 和 7 倍 ， 在 iPS 细 胞 实 验 中 也 提 高 了 4 倍 ； 而 且 不 同 组 合 的 重 组 转 座酶在不同类型细胞中效率也有不同，在 HEK293、 CHO 和 C17.2 细 胞 中 最 高 的 转 座 效 率 分 别 为 1.1%、 4.5%和 9.9%58。 HIV-TAT 蛋 白 含 有 一 段 能 够 引 导 整 个 蛋 白 进 入 细 胞 核 内 的 信 号 肽 59,60， 该 信 号 肽 与 PB 转 座 酶 融 合 后 能 够 引 导 转 座 酶 在 细 胞 核 聚 集 ， 从而 提 高 了 转 座 效 率 6

32、1。3 piggyBac 转 座 子 靶 向 插 入 的 改 造PB 转 座 系 统 介 导 的 外 源 片 段 转 基 因 只 能 识 别 基 因 组 中 TTAA 四 碱 基 序 列 ， 具 有 很 大 的 随 机 性 ， 一 旦 转 座 片 段 插 入 到 内 源 基 因 启 动 子 附 近 或 者 基 因 内 部 ， 就 可 能 引 发 基 因 沉 默 、 癌 基 因 表 达 等 。 而 且 PB 转 座 系 统 具 有 插 入 位 点 偏 好 性 ， 插 入 位 点 分 析 结 果 显 示 近 一 半 的 转 座 子 片 段 插 入 到 已 注 释 的 基 因 上 面 28,62，

33、因 此 插 入 片 段 可 能 干 扰 机 体 本 身 的 内 源 基 因表达，影响正常的生长发育。改变 PB 转 座 系 统 插 入 位 点 的 偏 好 性 ， 甚 至 靶 向 插 入 到 基 因 组 特 定 位 点 ， 将 有 助 于 基 因 组 研 究 ， 也 是 基 因 治 疗 的 必 要 条 件 。GAL4(Galactose regulated upstream promoter element) 能够专一性地识别 UAS(Upstream activator sequences) 序 列 ， 激 活 下 游 基 因 表 达 。 GAL4 之 所 以 能 够 专 一地 识 别 UA

34、S 序 列 是 因 为 GAL4 上 有 特 异 识 别 并 结 合 DNA 序 列 的 DNA 结 合 结 构 域 (DNA binding domain, DBD)， 如 果 利 用 GAL4 的 DBD 序 列 与 PB 转 座 酶 融 合 形 成 融 合 蛋 白 ， 那 么 转 座 酶 就 可 以 在 DBD 引 导 下 在 含 UAS 序 列 的 特 异 位 点 发 生 转 座 。 GAL4- piggyBac 在 埃 及 伊 蚊 细 胞 供 体 质 粒 转 座 到 受 体 质 粒 实 验 中 表 明 ， 有 67%的 转 座 片 段 插 入 到 预 先 设 定 的 UAS 序 列

35、附 近 的 TTAA 位置 33，在人 HEK293 细 胞 供 体 质 粒 转 座 到 基 因 组 实 验 中 ， 有 24%的 转 座 片 段 插 入 到 UAS 附 近 的 区 域 63。 但 是 ， GAL4-piggyBac 的 靶 向 插 入 需 要 在 基 因 组 上 有 UAS 序列，而一般情 况 下 靶 位 点 附 近 不 存 在 UAS 序 列 ， GAL4-piggyBac 融 合 蛋 白 依 然 不 能 满 足 自 主 选 择 插 入 位 点 的 要 求 。 腺 关 联 病 毒 (Adeno-associated virus)的 Rep 蛋 白 能 特 异 性 结 合

36、到 Rep 识 别 序 列 (Rep recognition se- quences, RRSs)， 单 纯 地 将 该 Rep 蛋 白 与 PB 转 座 酶 融 合 后 并 不 能 使 PB 转 座 片 段 特 异 性 插 入 到 基 因 组 RRSs 序 列 附 近 。 将 RRSs 序 列 预 先 插 入 到 PB 转 座 片 段 上 ， 虽 然 不 能 达 到 靶 向 插 入 的 目 的 ， 但 是 在 一定 程 度 上 改 变 了 PB 转 座 子 插 入 位 点 的 偏 好 性 64。 锌 指 蛋 白 (Zinc finger protein, ZFP)和 转 录 激 活子 样 效

37、 应 因 子 (Transcription activator-like effector, TALE)能 够 自 主 设 计 ， 具 有 特 异 性 地 识 别 和 结 合 到 对 应 序 列 的 能 力 65,66 ， 理 论 上 ZFP-piggyBac 和TALE-piggyBac 融 合 蛋 白 可 以 利 用 靶 向 作 用 将 转 座 酶 带 到 目 的 位 点 附 近 ， 实 现 目 的 基 因 靶 向 插 入 。 将 改 造 过 的 Checkpoint kinase-2 (细 胞 周 期 检 查 点 激 酶 2，CHK2)-ZFP 与 PB 转 座 酶 融 合 后 ， 和

38、供 体 转 座 片 段 一 起 导 入 到 人 HEK293 细 胞 内 ， 但 是 转 座 片 段 并 没 有 靶 向 插 入 到 基 因 组 上 ZFP 识 别 位 点 附 近 ； 进 一 步 通 过 预 先 在 基 因 组 上 插 入 一 段 CHK2-ZFP 识 别 位 点 和 富 含 TTAA 的序列后，尽管 ZFP-piggyBac 转 座 酶 与 原 始 PB 转 座 酶 转 基 因 效 率 类 似 ， 但 是 两 者 在 ZFP 识 别 位 点 附 近 发 生 转 座 的 细 胞 数 占 阳 性 细 胞 总 数 分 别 是 43.9%和 22.50%， 说 明 ZFP-pigg

39、yBac 融 合 蛋白确实具有一定的靶向倾向 35。TALE 相 对 于 ZFP 具 有 更 大 的 自 主 设 计 的 优 势 ， 可 以 直 接 在 基 因 组 上 选 择 合 适 的 位 置 设 计 结 合 位 点 。 TALE-piggyBac 融 合 转 座 酶 在 不 经 过 转 基 因 改 造 的 人 HEK293 细 胞 基 因 组 实 验 上 转 基 因 效 率 达 到 了 11%左 右 ， 但 是 靶 向 插 入 到 TALE 识 别 位 点 附 近 的 效 率 只 有 0.01% 0.014%34。 这 个 系 统 的 靶 向 插 入 效 率 仍 然 很 低 。 从 以

40、上 实 验 结 果 看 出 在 插 入 位 点 选 择 上 ， 融 合 蛋 白 仍 然 以 PB 转 座 酶 自 身 功 能 占 主 导 ， 融 合 的 DNA 结 合 蛋 白 靶 向 作 用 较 弱 。 从 这 一 点 可 以 看 到 ， 进 一 步 认 识 和 改 造 PB 转 座 酶 ， 将 PB 转 座 酶 的 催 化 区 域 与 TALE 等 DNA 特 异 性 结 合 蛋 白 融 合 ， 从 而 将 PB 转 座 酶 改 造 成 在 基 因 组 任 意 位 点 都 能 靶 向 插 入 的 新 型 转 基 因 工 具 ， 是 PB 转 座 酶 的 一 个 重 要 的 研 究 方 向

41、。4 piggyBac 转 座 子 导 入 外 源 大 片 段 基 因 的 能 力 改 进基 因 组 上 存 在 大 量 的 调 控 元 件 ， 对 基 因 表 达 有 重 要 的 调 控 作 用 。 但 是 受 到 转 基 因 载 体 片 段 长 度 的 限 制 ， 很 多 调 控 元 件 并 不 能 构 建 到 载 体 上 。 细 菌 人 工 染 色 体 (BAC)载 体 能 够 携 带 300 kb 大 片 段 DNA67。 PB 转 座 系 统 具 有 转 座 大 片 段 基 因 的 能 力 ， 联 合 利 用 PB 转 座 系 统 与 BAC 载 体 能 够 进 行 大 片 段 基

42、因 转 座 。 将 PB 转 座 子 的 左 右 臂 序 列 分 别 构 建 在 BAC 载 体 的 目 的 基 因 片 段 的 两 端 ， 构 建 了 转 座 片 段 长 度 分 别 为 28 kb、 70 kb 和 100 kb 的 3 个 BAC 载 体 ， 将 这 些 BAC 载 体 分 别 与 mPB 转 座 酶 或 hypPB 转 座 酶 (即 高 效 转 座 酶 mPB7)共 同 导 入 小 鼠 ES 细 胞 中 ， 转 基 因 实 验 均 获 得 成 功 27。 虽 然 转 座 效 率 随 着 转 座 片 段 的 长度 而 有 所 下 降 ， 但 即 使 是 100 kb 的

43、转 座 片 段 ， 经 HAT( 次 黄 嘌 呤 、 氨 基 喋 呤 和 胸 腺 嘧 啶 核 苷 酸 ) 和 FIAU( 非 阿 尿 苷 ) 药 物 双 筛 选 后 ， mPB 转 座 酶 和 hypPB 转 座 酶 的 转 基 因 阳 性 率 分 别 达 到 7% 和 29%27。 PB 转 座 系 统 介 导 的 BAC 载 体 转 基 因 技 术 在 人 ES 细胞上也获得成功，并且将转座片段扩大到 了 207 kb68,69。 将 含 207 kb 转 座 片 段 的 BAC 载 体 和 PB 转 座 酶 质 粒 共 同 导 入 到 HEK293 细 胞 中 ， 抗 生 素 筛 选 得

44、 到 60 个 左 右 阳 性 细 胞 克 隆 ， 反 向 PCR 实 验 证 明 有 13 个细胞克隆真正含有转座片段 68。利 用 原 核 显 微 注 射 技 术 共 同 注 射 PB 转 座 酶 和 BAC 载 体 到 小 鼠 受 精 卵 中 也 能 获 得 转 基 因 个 体 70。5 piggyBac 转 座 子 一 元 转 座 系 统 的 改 进供 体 质 粒 和 转 座 酶 辅 助 质 粒 构 成 的 PB 二 元 转座 系 统 在 细 胞 上 能 够 较 好 地 行 使 转 座 功 能 ， 但 是 在 单 精 子 胞 浆 内 注 射 (Intracytoplasmic sper

45、m injection,基 因 ， 需 要 检 测 大 量 的 分 子 标 记 和 杂 交 后 代 数 目 ， 耗 费 大 量 的 财 力 和 物 力 。 转 座 系 统 高 效 的 转 座 能 力 ， 以 及 本 身 即 可 作 为 分 子 标 记 的 特 点 ， 使 其 在 寻 找 表 型 相 关 基 因 过 程 中 能 够 发 挥 很 好 的 作 用 。 PB 转 座 系 统 在 遗 传 学 研 究 中 的 优 势 在 于 转 座 效 率 高 、 插 入 位 点 分 布 范 围 广 以 及 在 转 座 酶 存 在 的 情 况 下 可 以 进 行 自 发 地 转 座 。 在 含 有 PB

46、转 座 片 段 的 转 基 因 动 物 上 ， 只 要 与 含 有 PB 转座酶基因的异性同种动物交配，就 可 以 改 变 转 座 子 插 入 位 点 73， 能 够 方 便 地 进 行 大 规 模 的 功 能 基 因 筛 选 工 作 。 目 前 ， PB 转 座 系 统 已 经 广 泛 应 用 于 功 能 基 因 的 筛 选 7476。6.2 piggyBac 转 座 系 统 在 遗 传 疾 病 治 疗 上 的 应 用基 因 治 疗 的 目 标 是 通 过 靶 位 点 基 因 突 变 (敲 除 或 插 入 )， 使 得 靶 基 因 丧 失 功 能 或 者 重 新 恢 复 正 常 功 能。锌指

47、核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)57、 TALE 核 酸 酶 (Transcription activator-like effector nucleases,58,77ICSI)实 验 中 转 座 效 率 很 低 。 一 个 自 我 失 活 (Self-ina- TALEN) 和 CRISPR(Clustered regularly interspacedctivating)质 粒 可 以 实 现 PB 转 座 系 统 在 ICSI 中 的 应 short palindromic repeats, 成 簇 规 律 间 隔 的 短 回 文 重78,79用 71， 该

48、 PB 转 座 系 统 中 转 座 片 段 序 列 和 转 座 酶 基 复 序 列 )/Cas9(CRISPR-associated) 系 统 等 技 术 因 序 列 包 含 在 同 一 个 质 粒 中 ， 转 座 酶 基 因 的 启 动 子 构 建 在 转 座 片 段 的 ITR 内 ， 而 转 座 酶 编 码 基 因 构 建 在 转 座 片 段 的 ITR 外 ， 因 此 在 转 座 片 段 被 切 除 后 ， 转 座 酶 编 码 基 因 与 其 启 动 子 被 分 离 而 失 活 。 自 我 失 活 PB 转 座 系 统 质 粒 还 被 应 用 在 原 核 显 微 注 射 实 验 中 ，

49、 相 对 于 传 统 的 原 核 显 微 注 射 ， 转 基 因 效 率 提 高 了 5 倍 72。 但 是 该 系 统 中 转 座 片 段 内 含 有 一 段 启 动 子序列，可能因为 PB 转 座 片 段 的 随 机 插 入 ， 造 成 该 启 动 子 下 游 基 因 错 误 的 表 达 ， 因 而 也 存 在 一 定 的 风 险 。 另 一 种 PB 一 元 转 座 系 统 是 将 转 座 片 段 和 转 座 酶 构建在一个质粒中，并且将转座片段末端不含 TTAA 序 列 的 ITR 侧 翼 序 列 构 建 在 转 座 酶 基 因 两 侧 ， 该 系 统 不 仅 具 有 与 原 始 转 座 酶 相 似 的 转 座 效 率