1、第八章 毒理学评价的分子生物学方法分子毒理学固然应主要着眼于生物大分子，但也应当看到这些大分子是存在于细胞膜上、细胞器内，乃至细胞间隙液中的。它们与细胞是不可分离的。因此，对亚细胞组分的研究也是毒理学分子生物学评价的重要组成部分。第一节 亚细胞组分的制备现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。现就细胞膜、微粒体及线粒体的制备方法加以介绍。一、细胞膜的制备细胞膜指细胞外层质膜，厚度约 610nm 。它将细胞与外环境分隔，且参与细胞的生命活动，细胞内各种细胞器也是由质膜分隔，称为细胞器膜，两者统称为生物膜。它是常用的研究模型，用以从细胞和亚细胞水平研究外源化合物的中毒机制。1肝细
2、胞膜的制备其基本原理是：首先，将肝组织在含有钙离子的低渗碳酸氢钠缓冲液中温和匀浆，使细胞膜保持较大的膜片；其次，应用低速离心使细胞膜片与细胞核一起从匀浆中分离，再利用细胞膜与细胞核之间的密度差异，用密度梯度离心将细胞膜从低速离心获得的粗核部分中分离出来。2红细胞膜的制备哺乳动物红细胞不含任何细胞器，故其红细胞膜是较纯净的细胞膜。 (1)红细胞血影膜常用的制备方法是在低渗条件下，红细胞膨胀，由双面盘状变成近乎球形，随后细胞内容物因胞膜破裂而释放，20 000g 离心。洗涤去除血红蛋白，即获红细胞膜。此种膜最接近整体系统，仍保留着原有膜的生物化学和生物物理学等特性，毒理学试验常用简易模型研究外源化
3、合物对细胞膜离子转运及相关酶类、膜脂流动性和细胞骨架结构等方面的影响，并探讨其可能的机制。但它不能控制细胞质内的环境，在应用上有一定的局限性。此外，低渗制备的红细胞膜虽然去除了细胞内质，但膜的封闭性差，有许多泄漏的空穴。(2)再封血影近年发现，在一定条件下，胀破了的红细胞可以重新封闭，对 K等离子不通透，给研究红细胞膜提供了另一模式。其制备的方法有：向低渗胀破的红细胞加入浓盐溶液，成为等渗溶液，置于 37温育 20min，期间可缓慢地搅拌，即得一定比例的再封血影。将低渗胀破的红细胞在 0条件下，过 Biogel A 柱，柱上部的 13pH 为 76，以利膜与血红蛋白分离，其下的 23pH 为
4、60，有利于随后红细胞空泡的重新封闭，当膜从柱上流出后再用一定浓度的 Kcl 调节为等渗液，在 37温育 1h，即获得重新封闭的血影。(3)封闭的红细胞膜囊泡有时为了深入研究，需要将膜的内、外层翻过来。红细胞溶血后，在不含一价离子的碱性低离子强度介质中，膜能自发地凹陷(无 Mg“存在) 或外凸 (有 Mg“存在)，形成小囊泡，通过实验可制备封闭的红胞膜囊泡。其特点是不受胞浆内容物的干扰，可采用匀浆，等密度梯度离心或屏障分离等技术制备胞浆面在外的翻转泡(其内、外层正好与血影膜相反) 或胞浆面仍在内的正转泡(即与红细胞膜内外侧相同的囊泡 )。3脂质体的制备脂质体是双层脂质包围一些水溶液的小滴，呈球
5、形。它是最常用的人工膜之一，是较为理想的生物膜模拟系统。大脂质体制备可将适量的磷脂溶于氯仿等有机溶剂，置于旋转蒸发仪上蒸发至干，使玻璃壁上附有一层极薄的磷脂膜，然后加水溶液，并振摇，即可形成多层大脂质体。用超声波法和微量注射法、去垢剂法可获得单层脂质体。4突触体膜的制备制备突触体膜的基本原理是将脑组织在预冷的蔗糖溶液中进行匀浆，再利用脑突触体膜的蛋白质与脂的比例、电荷性质、颗粒大小、形状等不同于其他的细胞器膜进行蔗糖密度梯度离心，将其分离出来。二、微粒体的制备微粒体是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。由于微粒体含有代谢外源化合物的混合功能氧化酶，在毒理学研究中有着重要地位，是
6、较常见的试验模型。制备肝微粒体的方法有超速离心法、钙沉淀法、凝胶过滤法及等电点沉淀法。基本步骤为：将肝组织匀浆后，2500g 离心；弃去沉淀(主要是细胞核及碎片) ，取上清液 9000g 离心；弃去沉淀( 主要是线粒体) ，取上清液， 100 000g 离心，得到的沉淀即为线粒体，上清液为胞浆。所得微粒体用缓冲液悬浮后，贮存在一 20一 70冰箱中。除超速离心法制备微粒体外，用凝胶过滤、钙沉淀法和等电点沉淀法也可以制得微粒体。三、线粒体的制备1肝脏线粒体的制备所有操作应在低温条件下进行。全部器械如匀浆器、烧杯、离心管等，以及缓冲液应放 4冰箱内预冷。 2亚线粒体颗粒的制备亚线粒体颗粒是指经特殊
7、处理，除去线粒体外膜和基质部分后形成的小囊泡。它含有氧化磷酸化过程所有的酶类，是观察呼吸链氧化反应、ATP 酶活性及其他一些特殊反应的模型。亚线粒体颗粒制备的原理是利用超声波作用，破坏线粒体外膜，再经超速离心获得仅有内膜的亚线粒体颗粒。在超声处理过程中应注意保持线粒体制备物温度，不要升高，维持在 4以下。第二节 核酸的提取与制备核酸的提取是分子生物学中很重要的基本实验技术，也是其他分子生物学分析方法的前提条件。核酸样品的提取质量将直接关系到有关分析检测的成败。分离纯化核酸总的原则是应保证核酸一级结构的完整性及排除其他分子的污染。为了保证孩酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗
8、传信息全部贮存在一级结构之内。核酸的一级结构还决定着其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。经纯化的核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度，此外还要排除其他核酸分子的污染，如提取 DNA 分子时，应去除 RNA 分子，反之亦然。为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中应注意：尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在 DH410 的条件下进行。减少物理因素对核酸的降解。物理降解因素主要是机械剪切力，
9、其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式的破裂以及 DNA 样品的反复冻贮。机械剪切作用的主要危害对象是对分子质量大的线性 DNA 分子，如真核细胞的染色体 DNA。对分子质量小的环状DNA 分子，如质粒 DNA 及 RNA 分子，威胁相对小一些。高温，如长时间的煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中，常规操作温度为 04，此温度环境可降低核酸酶的活性与反应速率，减少对核酸的生物降解。防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破环核酸的一级
10、结构。其中 DNA 酶需要金属二价离子 Mg“，ca “的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐基本上可以抑制 DNA 酶的活性。而 RNA酶不但分布广泛、吸易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以生物降解是RNA 提取过程中的主要危害习素。总的来说，核酸提取的主要步骤就是破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质，纯化核酸等。核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。一、DNA 的提取与制备从细胞中提取 DNA 要用尽可能温和的细胞破碎法，以免 DNA 被机械
11、破碎。操作时还需要有 EDTA 的存在，以螯合镁离子，镁离子是 DNA 酶降解 DNA 所必需的。如果有细胞壁，要用酶进行消除，如用溶菌酶处理细菌，对于细胞膜要用去污剂溶解。对于不同来源的细胞、组织应使用不同的裂解液，如果必须使用物理破碎，一定要尽可能地轻缓。细胞破碎以及其后的操作都要在 4cIC 条件下进行，所用的玻璃器皿和溶液都要经过高压灭菌以破坏 DNA 酶。上述方法只适用于细胞总 DNA 的提取。不同来源的样品，处理时有不同的注意事项。对于新鲜动物组织脏器等提取材料，由于含有较丰富的 DNA 酶，应迅速冷冻保存备用，以减少 DNA 的降解；石蜡包埋组织块中 DNA 应先进行脱蜡处理；培
12、养细胞裂解之前应用相应的缓冲液进行洗涤；质粒 DNA 提取之前先要经过细菌培养，获得对数生长后期的细胞后进行离心集菌收集，再通过碱性裂解法、去污剂法或煮沸法等进行提取，纯化过程也可使用酚氯仿萃取法，对于小分子 DNA(小于 10kb)，可用涡旋混合器以保证溶液中有机相与水相混合均匀，当纯化 DNA 分子介于 1030kb 时，应轻微振荡，避免 DNA 被机械剪切，小于 30kh 的 DNA 分子纯化时应更小心。二、RNA 提取与制备RNA 提取技术与上述 DNA 提取技术相似。由于 RNA 分子相对较短，不易被剪切力损伤，因此细胞破碎可以用较强有力的方法。RNA 对 RNA 酶敏感，而 RNA
13、 酶在自然界广泛存在，不仅各种细胞内都有 RNA 酶，操作者的手指上也有 RNA 酶，因此操作者必须带手套，并且提取液中要有较强的去污剂存在，以便快速灭活 RNA 酶。接下来的去蛋白操作须特别强有力，因为 RNA 常常和蛋白质紧密结合在一起。用 DNA 酶去除DNA，用乙醇沉淀 RNA。RNA 提取要用硫氰酸胍它既是较强的 RNA 酶抑制剂，又是蛋白变性剂。制备 RNA 时所用物品应完全无 RNA 酶。第三节 基因突变分析与 PCR 检测一、基因突变分析基因突变(gene mutation)包括碱基置换、移码突变和片段突变(参见第五章第二节) 。基因突变是分子水平的变化，在光学显微镜下无法看见
14、，一般是以表型(如生长、生化、形态等) 的改乏为基础进行检测的，也可通过 DNA 测序、DNA 单链构象多态分析(sscP)、基因差异分析及基因芯片检测等分子生物学方法检测 DNA 序列的改变来确定。1PCRSSCP 技术聚合酶链反应单链构象多态性分析 在能够检测单个碱基变化的技术中，单链构象多态性分析因其简单而有效已成为最常用的技术。(1)PCRSSCP 的基本原理PCRSSCP 分析技术是一种 DNA 单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA 单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。首先 PCR 扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，在不含变性剂的中性聚丙烯酰
15、胺凝胶电泳中电泳。此时，DNA 单链的迁移率除与 DNA 链的长短有关外，更主要的是取决于 DNA 单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA 单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由 DNA 单链的碱基顺序决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的 DNA 单链，其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。靶 DNA 中如含单碱基置换或数个碱基插入、缺失等改变时因迁移率变化会出现泳动变位(mobility shift) ，从而可将发生突变的 DNA 与正常 DNA 区分开。经典的 PCRSSCP 技术采用放射性同位素标记引物或核苷
16、，再通过放射性自显影显示结果。但由于放射性同位素的污染及半衰期的问题，限制其推广应用。现已发展多种 PCRSSCP 技术，各有其优势及适用领域。例如，使用荧光素代替核素进行标记，也可以在电泳后用银染(银染显示法也称冷 sscp)。银染法利用对单链 DNA 亲和力较强的特点，大大提高了分辨率剂检测的敏感性，且技术操作简单、可重复性好，单链带型清晰，带与带之问易于识别，既避免了污染，又提高了灵敏性。此外，使用 RNA 分子来做 SSCP 会提高其灵敏度，尤其是对大于 200bp 的片段检测更显优势。RNA 分子形成的构象稳定、种类多，对单碱基置换等改变敏感，RNA 的 sscP 分析可检出多条单链
17、带，提高基因变异检出率，是 PCRSSCP 技术又一发展方向。（2）PCRSSCP 的优缺点PcRsscP 优点包括：技术原理明确，操作简单，不需特殊仪器，技术容易掌握；实验步骤少、速度快、周期短；检测灵敏度高，一般无假阳性结果；可运用于大样本筛查；可有效检测单碱基置换和多碱基插入、缺失等基因突变类型。但 PCRSSCP 也存在一些不足之处：1） 、该方法最突出的问题是不能检测出所有的突变，由各实验室报道的突变检出率从 35一 99不等，且分析片段太小，可能呈假阴性结果。由于随 DNA 片段大小的增加迁移率的改变明显减少，故该方法只适用于检测 150200bp 的 DNA 片段。一般来说，小于
18、 200bp 片段的检出率可达 90，而大至 400bp 的片段，其检出率只有 7080，片段越小，检出率越高。2） 、SSCP 分析影响因素较多。凝胶浓度和交联度、电泳温度、凝胶中甘油的浓度、电泳缓冲液的离子强度等均可通过影响 DNA 单链构象从而影响 DNA 单链的电泳迁移率，一种 PcR 产物单链的良好的电泳条件需要反复试验摸索。3） 、PCR-SSCP 分析只能发现是否有突变或碱基序列组成方面的变化，并不能了解 DNA 序列变化的性质及位点。解决问题的方法是将已知有改变的样本的 PCR 产物进行DNA 序列分析即 PCR、SSCP、DNA 测序三种方法的联用 (PCRSSCPDNASe
19、quencing 技术)。2DNA 测序基因突变检测的“金标准”是直接进行 DNA 测序，一些基因突变筛选方法得出的结论往往还需 DNA 测序来证实。经典的 DNA 测序就其原理来说主要分为化学降解法和 Sanger 双脱氧链终止法。在此基础上又发展了一些基于非放射物质标记和自动化测序的方法，近年来还发展了一些全新的 DNA 测序方法，如毛细管凝胶电泳法、阵列毛细管凝胶电泳法、超薄层凝胶板电泳法等以及不用电泳分离直接测序技术，如杂交法、质谱法、原子探针法、流动式单分子荧光检测法等。(1)化学降解法1977 年Ma。am 和 Gilb。rt 报道了通过化学降解测定 DNA 序列的方法，即化学降解
20、法(chem 。l cl。a。 。ge m。thod ，也叫 Mdxam Gilbert 法) 。它的原理是用一些特殊的化学试剂处理具末端放射性标记的 DNA 片段，分别作用于 DNA 序列中 4 种不同的碱基，使其在核苷酸序列中形成的糖苷键连接变弱，易从 DNA 链上脱落下来。丢失了碱基的核苷酸链再经适当处理，就可在缺失碱基处断裂。在进行这些反应时，将反应条件控制在每条 DNA 链断开一处，因此经过处理可产生一系列长短不等的 DNA 片段。根据所用的试剂不同，其末端分别为 G，A ，C，T ，再对一系列这样的片段进行电泳及放射自显影，综合分析，就可测得 DNA 分子中的核苷酸排列顺序。(2)
21、酶促双脱氧链终止法酶促双脱氧链终止法又叫 Sanger 法或链终止法(chain termination method)。由于这种方法要求使用一种单链 DNA 模板和一种合适的 DNA 合成引物，因此有时也叫引物合成法或酶催引物合成法。其基本原理是利用了 DNA 聚合酶所具有的两种酶催反应的特性：第一，DNA 聚合酶能够利用单链的 DNA 为模板，合成出准确的 DNA 互补链；第二，DNA 聚合酶能够利用 23一双脱氧核苷三磷酸作底物，使之参与到寡核苷酸链的 3一末端，从而终止 DNA 链的生长。在同一反应管中加入链终止剂 2，3一双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)中的某一种，以及引物、模板、dN
22、TPs 。ddNTP 能随机掺人合成的 DNA 链，一旦掺入，DNA 合成即终止，于是各种不同大小的片段起始端相同，而末端核苷酸必定为该种核苷酸。经电泳及放射自显影可从图谱上直接读出 DNA 序列。双脱氧法极适于大规模测序。(3)自动化测序法Sanger 双脱氧链终止法和 MaxamGilbert 化学修饰法在 DNA 测序原理上是公认的两大成就但两者也都存在着一些共同的问题有待解决。例如，这两种方法都需要使用放射性核素作为标记物，尽管灵敏度很高，但存在辐射危害，而且放射性材料在保藏、处理和运输方面也是相当麻烦的。再如，这两种 DNA 序列分析法都存在着操作步骤繁琐、效率低、速度慢等缺点(特别
23、是在结果的判断环节中 )。自 DNA 序列分析技术问世不久，为适应大规模测序的需要，许多科学家开始致力于 DNA 分析自动化方面的研究。自动测序仪的原理沿用 Sanger 等建立的双脱氧链终止法DNA 聚合酶催化延伸反应产生的 DNA 片段仍需通过序列胶电泳分离，采用荧光标记取代放射性标记，通过激光激发荧光，并与电子计算机程序的自动化技术相结合，达到自动检测碱基的目的。而在荧光染料标记方式上，美国应用生物系统公司 ABI 公司(applied biosystem)的自动 DNA 序列测定仪采用 4 种荧光基团标记，而欧洲分子生物学实验室(EMBL)与瑞典 PharmaciaILKB 公司联手推
24、出的全自动激光序列分析仪(AL F ，automated laser fluorescent sequencer)则采用了单种荧光素标记。使用 DNA 自动测序仪，熟练的操作者一天可以测 1000 个以上的碱基，而其他测序方法一般 1 人 1 年只能测 50 000 个碱基。这种方法因采用电子计算机控制，自动化操作，大大缩短了测定时间，而且结果准确可靠，是目前最优越的测序方法。(4)DNA 测序的新方法分子生物学技术的发展日新月异，除了上述 DNA 测序方法，近年来又发展了一些全新的 DNA 测序方法。以凝胶电泳为基础的测序方法在传统聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上又发展了毛细管电泳激光荧光法、超薄
25、层板电泳激光荧光法等技术。毛细管凝胶电泳比传统凝胶电泳分离速度提高了 25 倍，但 1 只毛细管只能分离1 个样品，因此分析效率并未提高。阵列毛细管电泳新方法的出现提高了分析效率。1992年，美国科学家采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25 只毛细管并列电泳，每只毛细管在15h 内可读出 350bp，DNA 序列分析效率可达到 6000bph。1994 年，日本科学家提出的另一种测序装置，20 只毛细管并列电泳，采用激光荧光电荷耦合阵列检测器(ccD)检测，有较高的灵敏度。采用 ccD 检测器， 100 只毛细管阵列电泳装置，可同时检测 100 只毛细管的 DNA 分离样品。使用超薄层凝胶板电泳进
26、行测序，凝胶板厚度仅为 50100 斗 m，配备流水冷却装置，场强提高到 250Vcm ，大幅度地提高了电泳速率。而一般的电泳胶厚度为200400 肛 m，电场强度较低 (75vcm)，限制了测序的速度。在此基础上如采用激光荧光 ccD 检测器检测，则可比常规电泳测序速度提高 9 倍，达到 8000bph 以上。不用电泳分离的测序新方法DNA 测序方法研究的一个热点是不用电泳分离的技术。这一类尝试主要包括：杂交法(sequencing by hybridization，SBH)，这是有希望用于快速 DNA 测序分析的一种新技术。它应用一套已知序列的寡核苷酸探针，与待测 DNA 样品进行杂交，寻
27、找靶 DNA 链上的互补序列，形成完全互补的双链，根据杂交情况排列出样品的序列信息。目前 SBH 技术用于同源序列的比较测定、点突变的检测已日趋成熟。SBH 作为一种快速、自动化的测序方法，相信未来几年中会有迅速发展，在今后的大规模测序以及分子生物学和基因诊断中发挥重要的作用。质谱法中发展较快的是基体协助激光解析离子化(MALDI)一时问飞行质谱法用来检测双脱氧循环产生的 DNA 片段的序列，相关的延迟离子抽提技术(delayed ion exlraclion，DEMALDI) ，可提高 MALDl 分析精度，还有 MALDI 一FOFDNA 测序方法。这一类技术提供了一种新的非凝胶碱基 DN
28、A 测序方法，最终有可能比传统的方法学更加快速，并为将来的大规模质谱 DNA 测序提供了可能。原子探针显微镜、扫描隧道显微镜(sTM)和原子力显微镜 (AFM)新技术的发展，使快速、高分辨直接观测 DNA 分子构象成为可能。流动式单分子荧光检测法也在发展中。3荧光原位杂交原位杂交(ISI，in situ hybridization)，是一种在保持组织、细胞或染色体原有形态结构的基础上，对其内部特殊核苷酸顺序进行检测及定位的分子生物学手段，可用于染色体畸变分析。其原理是将已标记或经特殊修饰的核酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中的 DNA、RNA 杂交，继而通过分析标记探针在被检对象中的显示状况
29、而达到对特殊目标顺序进行检测、定位的目的：用放射性同位素标记探针和放射自显影曾一度作为惟一、高度敏感的 IsH 手段。近年来，利用化学修饰合成核苷酸 (如 diguTP，duTP 及 ddUTF。等)，并将这些核苷酸掺入可与被检目标序列杂交的 RNA、DNA 或寡核苷酸片段中，杂交后通过荧光法、酶沉淀法或发色团检测来鉴定目标序列是否存在及其位置。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FIsH)是目前最常用的 ISH 手段之一。(1)荧光原位杂交的原理和特点荧光原位杂交的基本原理为：只要两个核酸分子的碱基序列互补，就可在适宜条件下形成稳定的杂交分子。
30、FISH 就是利用这一原理将标记探针同组织、细胞核或染色体DNA 进行杂交，在下改变其结构和分布格局的情况下进行细胞内 DNA、RNA 某特定序列的测定。FISI-I 可用于染色体精细结构分析，非整倍体检测，中期、间期细胞染色体数目分析，微核来源鉴定及精子非整倍唪检测。荧光原位杂交技术具有操作及观察分析简便、立体分辨率高、信号明亮清晰以及安全风险性小等优点。此外，利用不同荧光物质所修饰的核苷酸标记不同探针，可在同一样品中同时识别和分析多个目标顺序。特别是 20 世纪90 年代发展起来的多色 FISH 计术，在同一细胞核或中期染色体中显示出不同的颜色，从而可同时检测 2 种以上 DNA 的二维结
31、构，制备出染色体的光谱核型，使全染色体的自动化分析得以实现，大大拓宽了 FSH 的应用范围。而 20 世纪 90 年代出现的 DNA fibre。一FISH，除显著提高了 FISH 的空间分辨率外，也使 FlsH 灵敏度进一步提高。(2)荧光原位杂交技术一般程序一般包括探针制备、组织或细胞的处理、杂交以及信号的显示与分析。其流程如下：DNA 探针标记(利用化学修饰合成的核苷酸进行缺口平移、随机引物或 PcR 扩增标记) 已经固定的组织、细胞或染色体与探针的变性处理 D 37qC 湿盒内杂交 272h荧光显微镜下直接检测杂交信号(探针上的信号分子可被激发荧光)以荧光标记抗体与探针信号分子结合 D
32、 荧光显微镜下观察杂交信号具体操作步骤包括：制备和标记探针在遗传毒理学研究中一般用 DNA 探针。目前识别畸变的 FIsH 探针大致可分为染色体序列探针、由许多 DNA 大片段组成的全染色体探针和着丝点探针。现在主要通过质粒重组、PcR 扩增和人工合成等 3 种途径制备探针。常用的探针信号标记方法有 2 种：直接标记法。将荧光分子直接标记于探针 DNARNA 上，杂交后可直接在荧光显微镜下检测，这种方式快速简捷，背景干扰很少，但杂交信号较弱，且不能进一步放大，目前已较少采用；间接标记法。采用一个中间分子标记探针，杂交后再用生物素或地高辛等荧光分子标记的中间分子的亲和物或抗体进行检测。染色体原位
33、杂交杂交前变性处理染色体标本，使染色体 DNA 变为部分单链，并去掉附着的 RNA 及蛋白质，变性处理生物素或地高辛修饰的探针。变性常用加热或碱变性，变性的温度和时间随探针和组织类型的不同而变化，目的是为了保存组织的完整性和最大的杂交效率。变性后的探针与变性后的染色体单链 DNA 在适合的温度、盐浓度等条件下复性杂交成双链。此后，经一系列洗涤，将标本中未结合的探针或非特异性杂交的探针全部洗净。荧光检测清洗后的标本用荧光标记的试剂进行检测，对生物素标记的探针一般用荧光标记的卵白素检测，而其他中间分子，主要采用荧光标记的相应抗体来检测。常用的荧光标记分子有 AMCA(蓝光)、异硫氰荧光素( 绿光)
34、、罗丹明( 红光)、德州红(深红) 等。染色体显带通常在杂交后显带，如先进行常规显带，再进行 FISH 会明显降低杂交信号的检出率。常用的显带方法包括：ActinomycinDAPI 显示 G 带、经溴脲嘧啶处理后再由 Hoechest 显示 R 带。或采用 Alu 或 Line 重复序列与探针同时进行杂交，亦可得出显示 G 带或 R 带的效果。荧光显微镜检测荧光染料受到特定波长的光波激发便会在其所排布的位置上发光。此时选择合适的滤色镜，可在同一分裂相上观察到不同颜色的标记物。荧光镜检时显微镜的质量及滤片的选择至关重要，特别是滤片系统，应严格按照相应荧光分子的荧光激发发射光波长，选择最适的激发
35、阻挡滤片组合。摄影记录系统由于固态电荷耦联扫描装置及图像分析仪的应用，可以使背景着色很大程度地减低。应用激光共轭聚焦显微镜，可通过对染色片标本的不同平面进行断层扫描，并将得到的结果经计算机处理，获得高质量的图像结果。4基因差异分析分子生物学的许多杂交、扩增技术都依赖于特定的探针或引物，才可检测到基因改变的情况。而某一基因的探针或引物的设计是在对该基因序列有一定了解的前提下进行的。对于未知序列的分析，此类方法往往无用武之地。各种化学毒物和环境危害因素引起的基因改变或新基因的出现大多是未知的。对于此类基因的分析更多应用的是差异分析技术。目前应用较多的是 mRNA 差异显示法以及新近发展的 cDNA
36、 代表性差异分析法。(1)mRNA 差异显示法IJiang 和 Pardee 等于 1992 年最早报道了差别显示法(DDRTPCR，mRNA differential display)。其一般原理是，对 mRNA 进行反转录合成 cDNA，在此基础上对每一类 cDNA 的 PCR 选择性扩增产物进行凝胶电泳分析，寻找差异片段。该方法主要由以下三部分组成：用 3锚定引物对 DNA 进行逆转录；用 3，锚定引物及若干数量一定长度的 5随机引物对逆转录后的 cDNA 进行PCR 扩增，以获得代表不同 mRNA 的 cDNA 片段；用测序胶分离 PCR 扩增后的 cDNA 片段，得出的差异片段在相同
37、条件下再进行 PCR 扩增、分离、纯化、克隆和测序，即可得到差异片段的序列。差别显示技术的不足之处主要是高频率的假阳性，有时甚至高达 70以上。为了消除假阳性，应严格设置对照。Sompayrac(1995)曾提出一些降低假阳性的策略。近几年来随着此项技术的应用日益广泛，其方法也在不断改进之中。(2)cDNA 代表性差异分析法1994 年 Hubank 等建立 cDNA 代表性差异分析(cDNARDA，cDNA representational differ。 。 。 。 。 d。 。lv 。i。)。该技术的基本原理是将差减杂交与 PCR 有机结合，利用双链 DNA 为模板时可通过 PCR 呈指
38、数扩增，而单链 DNA 为模板时呈线性扩增的原理，首先制备 cDNA 并用限制性内切酶消化成平均长度为 256bp 的 cDNA 片段，随后利用 PCR 技术使 cDNA 片段得以富集。接着连续进行 3 次差减杂交，最后再利用 PCR 技术富集特异表达基因。差减杂交法的工作过程是：从基因表达特异的组织中提取 mRNA，反转录为cDNA，然后与基因无特异表达的组织中提取的 mRNA 过量杂交，在基因特异表达的组织与基因无特异表达的组织中均表达的基因产物形成了 cDNAmRNA 双链杂交分子，而特异 mRNA 转录的 cDNA 仍保持单链状态，将这种单链 cDNA 分离出来即为差异表达的序列。由于
39、。DNARDA 能发现与表型相关的基因异常，并能随基因表达的时效性不同而分离出表达差异的基因，从而对基因的结构和功能有更多的了解。与 mRNA 差异显示法相比，由于 RDA 进行了消减杂交，从而大大地减少了 mRNA 差异显示中易于出现的假阳件结果。同时，由于消减富集和 PCR 动力学富集的特点，可使 mRNA 差异显示法中难以显示的稀有 mRNA 的 cDNA 得以富集并予筛选和克隆。在毒理学领域，基因差异分析用于寻找外源化合物或环境诱导基因的研究才刚刚开始，但由于其在寻找未知新基因方面的独特优势，必将为分子毒理学的深入研究做出贡献。5基因芯片检测基因芯片(gene chip)，又称 DNA
40、 芯片。基因芯片技术是新近出现的将计算机科学、核技术、物理学、数学等学科的多种理论和技术有机结合而发展起来的具有划时代意义的新的基因分析方法。它将成千上万个寡核苷酸固定在厘米大小的硅片上，将待测的材料用荧光素或核素标记，在基因芯片上与探针杂交，通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描获取杂交探针的荧光信号。其制作方法包括：原位合成法(in situ sy。nthesis)、离片合成法(off chip synthesis)及大规模的 cDNA 微排列。基因芯片的突出特点是可准确地确定突变位点及突变类型，尤其是可以同时检测成千上万个基因乃至整个基因组的所有突变。它将核酸样品制备、核酸扩增和定性定量检测
41、等一系列繁复的过程连续化和微型化，使其高度集中在一块数英寸大的固相支持物上，可用于 DNA 测序、转录情况分析、基因诊断与基因药物分析设计、突变及多态性检测遗传作图等方面的研究。二、有害微生物的 PCR 检测PcR(I)olyITleIasj chain reaction)即聚合酶链式反应，是 20 世纪 80 年代发展起来的一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法，故又称为基因的体外扩增法，也称为无细胞克隆系统。它可以在试管中建立反应，数小时后能将极其微量的目的基因或某一特定的 DNA 片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，并且无须通过烦琐费时的基因克隆程序便可以获得足够数量的精确的 DN
42、A。随着人们对食品安全性要求的不断提高，PcR 技术以其特异性强、灵敏度高和快速准确等优点在食品有害微生物检测领域得到广泛的应用。1PCR 的技术原理根据已知的待扩增 DNA 片段序列，人工合成与该 DNA 两条链末端互补的两段寡核苷酸引物，在体外将待检 DNA 序列(模板) 在酶促作用下进行扩增，这种方法也就是 PcR 技术。扩增过程中高温变性(denatu ration)、低温退火(annealing)和适温延伸(extension)等 3 步反应作为一个周期，反复循环，从而达到迅速扩增特异性 DNA 的目的。高温变性是在体外将含有需扩增目的基因的模板双链 DNA 经高温处理，分解成单链模
43、板；低温退火降低反应系统温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物与目的 DNA 互补结合，形成部分双链；适温延伸是将反应循环系统的温度调至适温，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，有 4 种核苷酸存在时，引物链将沿着 5一 3方向延伸，形成与模板互补的新链，新链又可作为下一次反应的模板，如此周而复始使目的基因的数量呈几何级数扩增。在扩增初期，目的 DNA 分子呈几何级数 2“(n 为循环次数 )增加，随着循环次数增加，模板 DNA 不断增加和酶分子的消耗，扩增效率下降，DNA 分子呈线性(1+x)”增加(x 为 DNA 分子实际增长率)，经过2030 次循环，单一拷贝的基因可扩增 10210倍。PcR
44、 技术检测的主要步骤为： 运用化学手段对目标 DNA 提取；设计并合成引物，引物设计与合成的好坏直接决定 PcR 扩增的成效，通常要求引物位于待分析基因组中的高度保守区域，长度为 1530 个碱基为宜；进行 PCR 扩增；克隆并筛选鉴定PcR 产物，将扩增产物进行电泳、染色，在紫外光照射下可见扩增特异区段的 DNA 带，根据该带的不同即可鉴定不同的 DNA；DNA 序列分析，不同的对象如扩增 DNA 片断序列全知、半知或未知，其 PcR 参数、退火温度、时间、引物等都有较大的差别，将限制片长多态性(RELP， 。restriction fragment，length poly-一 morphy
45、sm)、序列测定(Sequenc：)、反转录 PcR(RTPCR)等技术相结合，形成了众多的衍生技术，如巢式 PCR(nested PCR)、定量 PCR(quantitatjveP(：R)、竞争 PCR(competitiveP(：R) 、单链构型多态性 PcR(SS(：PPcR)等。这些技术的产生将使 PcR 技术在食品中的应用潜力更加广泛。2PCR 在食品有害微生物检测方面的应用在食品有害微生物检测方面，PcR 常用于鉴定某些人工培养困难、不能活体检查或分离困难且菌数较少的细菌疾病的检测。PcR 用于 DNA 病毒的检测一般无需提取DNA，可直接取少量样品，煮沸变性后进行 PcR 测定。
46、PcR 用于 RNA 病毒的检测，必须提纯病毒 RNA，在 PcR 扩增前需转录成 cDNA，再加入与 cDNA 互补的另一引物，用 PcR扩增出嵌合分子即逆转录 PCR(RTPCR)。传统方法检测食品中致病菌的步骤烦琐费时，需经富集培养、分离培养、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程，并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测。而应用 PcR 技术，只需数小时就可以电泳法检测出01 mg DNA 中仅含数个拷贝的模板序列。用 PcR 扩增细菌中保守的 rDNA 片段，还可对那些人工无法培养的微生物进行检测。用 PcR 检测食品中的致病菌，首先要富集细菌细胞，
47、通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞，然后裂解细胞，使细胞中的 DNA 释放，纯化后经 PCR扩增细胞靶 DNA 的特异性序列，最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的 DNA 序列。对于食品体系的微生物检测，通常可采用预增菌培养程序，既增加了目标微生物的量，又去除了食品体系中存在的抑制因子，大大提高了检出率。 (1)检测单核细胞增生李斯特菌单核细胞增生李斯特菌是食品卫生中的重要病原菌，多通过食品经口感染，被列为 20 世纪 90 年代食品中的 4 大病原菌之一。有关单核细胞增生李斯特菌污染乳制品、肉、禽、蔬菜的研究国内外均有报道。该菌可诱发食物中毒，导致李斯特菌病，主要引起人类
48、脑膜炎、菌血症等，发病率虽低，死亡率却高达 3070。在食品李氏杆菌的检测中，过去一直缺乏简单快速的分离鉴定技术，传统方法从食品中分离、鉴定该菌约需 12 周才能得出结果，免疫学方法和基因探针已用于该菌的快速检测，但前者可达到属水平的特异性，后者敏感性差。PcR 技术的引入可使检测过程大为缩短。李氏溶血素 0 基因与内化素基因是单核细胞增生李斯特菌最主要的致病因子与侵袭因子，针对其毒力基因可设计特异性高的引物，快速扩增。有报道对食品中李氏杆菌的溶血 0 基因进行 PcR 扩增，结果可在12h 内完成整个检测过程，对食品样品中李氏杆菌的检测限可达 550 个细菌。(2)检测金黄色葡萄球菌金黄色葡
49、萄球菌是各种类型感染和食物中毒的病原菌，能在食物内增殖并产生体外毒素肠毒素、内毒素中毒休克综合症毒素和脱皮毒素。目前金黄色葡萄球菌肠毒素 D 的鉴定主要依赖于免疫学技术，该技术需要细菌纯培养和制备肠毒素，实验周期长、步骤繁多，使其在食品卫生学鉴定时受到限制。近年来 PCR 技术的发展为食品病原微生物的鉴定提供了新的途径。(3)检测沙门菌沙门菌是一种人畜共患的传染性病原菌，近年来，对沙门菌快速诊断的方法已有了很大进展，如应用 ELlsA 法、EIA 技术、间接血凝抑制试验、 HRPSPA 染色法和 PcR技术等。PCR 技术由于具备高度特异、灵敏和快速的特点，已引起越来越广泛的重视。(4)柃测致病性大肠杆菌肠毒素大肠杆菌是弓 I 起婴幼儿和幼畜腹泻的主要病原菌之一。该菌可产生 2 种肠毒素：热敏性肠毒素和耐热性肠毒素，它们均能引起肠黏膜细胞水与电解质的代解紊乱并导致腹泻。肠毒素大肠杆菌引起的腹泻主要是食入了被该菌污染的食品所致。PCR 技术为临床和实验室提供了一个更为快速灵敏的检测
