1、肠膜明串珠菌基因失活体系的建立Advances in Microbiology 微生物前沿, 2014, 3, 57-63 Published Online September 2014 in Hans. http:/www.hanspub.org/journal/amb http:/dx.doi.org/10.12677/amb.2014.33007Construction of Gene Inactivation System for Leuconostoc mesenteroidesXiaoyan Ju, Zhou Zhang, Wenyu Cheng, Hongxing Jin*Sch
2、ool of Chemical Engineering and Technology, Hebei University of Technology, Tianjin * Email: Received: Aug. 1 , 2014; revised: Aug. 27 , 2014; accepted: Sep. 10 , 2014 Copyright ? 2014 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International Lic
3、ense (CC BY). http:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/st th thAbstractTo develop an efficient gene inactivation system for L. mesenteroides, tetracycline-resistant gene cassettes were ligated with pTA2 T vector. Then upsteam and downsteam flanking regions of the ack (acetate kinase) gene were dire
4、ctionally inserted into left and right MCS (multiple cloning site) of the T vector, respectively. The resulting homologous recombination suicide vector was transformed into Leuconostoc. The ack gene of chromosome was inactivated and a mutant strain was obtained. To confirm whether ack was inactivate
5、d, the ability of mutant strain synthesizing acetic acid was analyzed and an ack fragment was amplified by PCR. PCR analysis showed that a fragment of ack gene in the mutant strain was 1200 bp longer than that in the original strain. Compared with the original strain, the yield of acetic acid in the
6、 mutant was decreased by 49.1%. The results indicated that ack gene was successfully knocked out. The gene inactivation system for L. mesenteroides was constructed.KeywordsLeuconostoc, Gene Inactivation, Homologous Recombination, Acetate Kinase肠膜明串珠菌基因失活体系的建立莒晓艳，张 舟，成文玉，金红星*河北工业大学化工学院，天津 * Email: *通
7、讯作者。57肠膜明串珠菌基因失活体系的建立收稿日期：2014 年 8 月 1 日；修回日期：2014 年 8 月 27日；录用日期：2014 年 9 月 10 日摘要构建肠膜明串珠菌的基因失活体系。四环素抗性基因表达盒连接到 pTA2 T 载体上，在 T 载体的左右多克 隆位点上分别定向插入 ack(乙酸激酶)的上、下游同源臂，构建成自杀性同源重组载体，转化明串珠菌， 使染色体的 ack 失活，得到突变型。检测突变型产乙酸的量并利用 PCR 验证ack 失活。与原始菌株相比， 突变型的乙酸产量减少 49.1%；突变型的 ack PCR 扩增产物比原始菌株的大 1200 bp 左右。成功地使 a
8、ck 基因失活，说明肠膜明串珠菌基因失活体系的构建成功。关键词明串珠菌，基因失活，同源重组，乙酸激酶1. 引言明串珠菌(Leuconostoc) 是韩国泡菜、德国泡菜和腌菜等发酵蔬菜中的优势细菌，在保持产品的质量 中起着重要作用 1 。明串珠菌是耐氧的革兰氏阳性细菌 2 ，底物通过戊糖磷酸解酮酶 (Pentose PhosphoKetolase, PPK)途径而脱氢并产生能量(见图 1)。 明串珠菌在食品和医药工业中具有生成双乙酰、葡聚糖、甘露醇和 2, 3-丁二醇、代谢产生细菌素等 应用3 4。明串珠菌是美国 FDA 认可的 GRAS 菌，也是国家卫计委认可的安全菌5，不产内毒素，能 分泌特
9、异性胞外蛋白且没有蛋白降解活性，因此明串珠菌是表达异源蛋白的很好的候选菌6。 产业升级转化过程中甘露醇和 2, 3-丁二醇等化学品需要微生物发酵产生，从而有利于绿色和环保。 还有，明串珠菌的染色体基因组只有 2 Mb 左右7 ，故发酵周期短且可作为底盘生物或精简基因组而构 建成优势小基因组微生物。 因此， 明串珠菌具有巨大的应用价值， 已成为国内外学者的研究热点 8-15。Figure 1. The main carbon metabolic pathway of L. mesenteroides 图 1. 肠膜明串珠菌主要碳代谢途径58肠膜明串珠菌基因失活体系的建立本文以乙酸激酶基因 ack
10、 为目标序列，以四环素为筛选标记，构建自杀性重组质粒，转化肠膜明串 珠菌，使染色体上基因失活，获得突变型菌株。通过 PCR 扩增和产物检测，验证基因失活体系的构建成功。2. 材料与方法2.1. 材料2.1.1. 菌株与质粒 本文所用的菌株和质粒，见表 1。 2.1.2. 试剂和仪器 工具酶为 TaKaRa 的；其它试剂为分析纯；主要仪器有 DL9700 型基因扩增仪、 Bio-Rad Gene Pulser XcellTM 电击仪、722N 型可见分光光度计。 2.1.3. 培养基和培养条件 在 37、150 r/min 下用 LB 培养大肠杆菌；在 30、 120 r/min 下用 MRS1
11、6培养肠膜明串珠菌。2.2. 方法2.2.1. DNA 操作 明串珠菌基因组 DNA 的提取参照文献16，电转化参照文献9 。 大肠杆菌的质粒提取参照文献17，大肠杆菌的转化采用 CaCl2 法。 引物序列见表 2，PCR 扩增过程见表 3。 2.2.2. ack 的 PCR 扩增与测序 参照 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293(GenBank accession number CP000414) 的乙酸激酶基因(ack)序列设计引物对 A1-A2，扩增 ack。将扩增产物连接到 pTA2-T 载体上，转化大肠杆 菌
12、 DH5，送样测序。Table 1. Bacterial strains and plasmids used in this study 表 1. 实验所用的菌株和质粒Strains or plasmids Bacterial strains E. coli DH5 CGMCC1.10327 Leu ack:Tet Plasmids pBR322 pTA2-T pTA2-ack pTA2-Tet pTA2-T-U pTA2-T-U-D TetR T-Vector, 2.98kb, AmpR, lacZ pTA2 containing ack fragment from L. mesentero
13、ides pTA2 containing Tet fragment from pBR322 pTA2-Tet containing ack upstream fragment from pTA2-ack pTA2-T-U containing ack downstream fragment from pTA2-ackR RPhenotypes and correlative charactersSources80 LacZM15, deoR, recA1, endA1, hsdR17, supE, thi, gyrA, relA L. mesenteroides CGMCC1.10327 wi
14、th ack knock-outThis lad This lad This workThis lad TOYOBO This work This work This work This work59肠膜明串珠菌基因失活体系的建立 Table 2. Primers used in this study 表 2. 实验所用的引物Primers T1 T2 A1 A2 U1 U2 D1 D2 Y1 Y2 Sequences(53) TTTGACAGCTTATCATCGA ATTCTTGGAGTGGTGAATC TGCAATCATCACAGTTAAG CTTAATTACTGACGTGCAC TTTC
15、GGTACCCATCACAGTT(KpnI) GCAGTCTCGAGCGTTCAGTTA(XhoI) ATAGTCTGCAGTCATTTAGGT(PstI) CAGCTCTAGACTTCTTCATTTA(XbaI) GGGTTGTTGTTGATGATG TGTGCGTGAGTATTGGTTTable 3. Steps of PCR 表 3. PCR 步骤Fragment TetR ack upsteam fragment downsteam fragment recombination confirmation 94?C 5 min Denaturation Circulation (30)
16、94?C 30 s, 47?C 30 s, 72?C 1 min 94?C 30 s, 50?C 30 s, 72?C 1 min 94?C 30 s, 52?C 30 s, 72?C 30 s 94?C 30 s, 52?C 30 s, 72?C 30 s 94?C 30 s, 50?C 30 s, 72?C 90 s 72?C 10 min Extension2.2.3. 同源重组载体的构建 参照质粒 pBR322 序列， 设计引物对 T1-T2， 扩增四环素抗性基因表达盒， 将扩增产物连接到 pTA2-T 上，转化大肠杆菌 DH5，提取质粒得到中间载体 pTA2-Tet。根据扩增的 ac
17、k 序列设计引物对 U1-U2， 扩增 ack 上游片段，将扩增产物连接到 pTA2-Tet 的 KpnI 和 XhoI 位点上，转化 DH5，提取质粒得到 pTA2-T-U； 设计引物对 D1-D2， 扩增 ack 下游片段， 将扩增产物连接到 pTA2-T-U 的 PstI 和 XbaI 位点上， 转化 DH5，提取质粒得到同源重组载体 pTA2-T-U-D。 2.2.4. 肠膜明串珠菌的电转化 同源重组载体 pTA2-T-U-D 转化肠膜明串珠菌， 从平板上挑取单菌落进行液体 MRS 培养， 用 5 g/mL 四环素和 5 g/mL 氨苄检验菌株的抗性。 保留具有四环素抗性且对氨苄敏感的
18、菌株， 作为疑似失活菌株。 2.2.5. 突变型菌株的 PCR 验证 分别在 ack 基因上游和下游片段序列上设计引物 Y1、Y2，提取疑似失活菌株的基因组 DNA 作为模 板，通过 PCR 验证菌株的 ack 基因是否失活。 2.2.6. 发酵实验 以 1%接种于 MRS 中，发酵 24 h 后参照文献18-21检测培养基中的乙酸、乳酸、乙醇、双乙酰和 甘露醇含量。60肠膜明串珠菌基因失活体系的建立3. 结果与分析3.1. ack 基因克隆和序列同源性约 1.1 kb 的 PCR 扩增片段连接到 pTA2-T 载体上， 转化 DH5， 获得重组子， 重组质粒命名为 pTA2-ack。 测序分
19、析表明长度为 1112 bp， 与 L. mesenteroides ATCC8293 的乙酸激酶基因序列比对结果： 核酸序列同 源性为 99%，有 9 个碱基的差异，氨基酸序列同源性为 100%。已提交到 GenBank，接收号为 JF837336。3.2. 同源重组载体的构建以质粒 pBR322 为模板， 扩增 TetR 基因表达盒， 获得的 PCR 产物长约 1.2 kb， 与 pTA2-T 载体连接， 重组质粒命名为 pTA2-Tet。 扩增的 ack 上游片段为约 500 bp， 与 pTA2-Tet 连接， 重组质粒命名为 pTA2-T-U。 扩增的 ack 下游片段大小约 450
20、 bp，与 pTA2-T-U 连接，同源重组载体命名为 pTA2-T-U-D。3.3. 疑似失活菌株的筛选将 pTA2-T-U-D 经电击转化肠膜明串珠菌后，涂布于含四环素的 MRS 平板上，保留抗四环素而对氨 苄青霉素敏感的重组子(发生二次交换的)，废弃对四环素和氨苄青霉素都具有抗性的重组子(只发生一次 交换的)，从而获得疑似失活菌株。3.4. 疑似失活菌株的 PCR 检测为了验证疑似失活菌株染色体上的 ack 基因已被失活，对重组子进行了 PCR 检测。分别以 CGMCC 1.10327(原始菌株)和疑似失活菌株的染色体 DNA 为模板，用相同的引物对 Y1-Y2 进行 PCR 扩增，对得
21、 到的产物进行琼脂糖凝胶电泳。疑似失活菌株的扩增产物长度比 CGMCC1.10327 的大 1200 bp 左右(图 2)，与预期结果一致。将该疑似失活菌株命名为 Leu ack:TetR。3.5. 种菌株的生理特性比较为了进一步验证 ack 基因的失活并研究 ack 基因失活对肠膜明串珠菌碳代谢的影响，用 MRS 进行发 酵 24 h 时并考察乙酸、乙醇、乳酸、双乙酰、甘露醇的量。 在相同条件下，CGMCC1.10327 和 Leu ack:TetR 两种菌株的生物量基本一致。比较两者的代谢产物M 1 23000 2000 1500 1200 1000 530 1700500M: DNA m
22、arker; 1: PCR fragment of ack of CGMCC1.10327; 2: PCR fragment of ack of presumed mutantFigure 2. Characterization of defined ack inactivated mutant by PCR analysis 图 2. ack 基因失活菌株的 PCR 鉴定61肠膜明串珠菌基因失活体系的建立 Table 4. Comparison of fermentation parameters of the two strains (Unit: g/L) 表 4. 两菌株的发酵参数比较(
23、单位：g/L)Strains CGMCC1.10327 Leu ack:TetRAcetic acid 0.40 0.02 0.21 0.01Diacetyl 1.56 0.06 1.31 0.04Ethanol 2.02 0.11 2.18 0.12Lactate 9.15 0.31 9.14 0.26Mannitol 3.04 0.11 3.02 0.09表明，突变菌株的乙酸浓度为 0.20 g/L，比原始菌株少 49.1%；突变菌株的双乙酰浓度为 1.21 g/L，比原 始菌株少 16.3%；突变菌株的乙醇浓度为 2.21 g/L，比原始菌株高 8.3%；产乳酸和甘露醇的差不多(见表 4
24、)。4. 讨论自然情况下，菌体内自发的同源重组效率相当低。2008 年韩国的 Eom22以摘要形式报道过柠檬明 串珠菌的基因失活， 此后还没有明串珠菌的相关报道。 本研究成功建立了肠膜明串珠菌的基因失活体系。 本研究使肠膜明串珠菌的 ack 基因失活， 从而阻碍了乙酸合成， 导致乙酸的量减少和乙醇的量增加， 符合理论上的预期结果。由此可见，乙酸的合成没有完全阻断，因为染色体上存在另一个拷贝的乙酸激 酶基因(已克隆该 ack，GenBank 的接收号为 JF809796)。若使另一个拷贝的 ack 也失活，就可以改造成为 高产乙醇的明串珠菌菌株。5. 结论本研究成功地使染色体的 ack 基因失活
25、，说明肠膜明串珠菌基因失活体系的构建成功。项目基金天津市科技计划项目(“明串珠菌发酵生产甘露醇研究”，No. 12ZXCXSY06900)；河北省自然科学 基金项目(“通过基因敲除研究明串珠菌的中心碳代谢调控”，No. C2011202112)；河北省科技支撑计划 项目(“以甘蔗/ 红糖为原料用明串珠菌发酵生产甘露醇”，No. 13212405)。参考文献 (References)1 2 成文玉, 金红星 (2012) 明串珠菌的基因研究进展. 中国酿造, 2, 24-28. Eom, H.-J., Cho, S.K., Park, M.S., et al. (2010) Characteri
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