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1、第三章 蛋白质第一节 蛋白质概论蛋白质是所有生物中非常重要的结构分子和功能分子，几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的结果，因此，蛋白质是现代生物技术，尤其是基因工程，蛋白质工程、酶工程等研究的重点和归宿点。一、 蛋白质的化学组成与分类1、 元素组成碳 50% 氢 7% 氧 23% 氮 16% 硫 0-3% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼凯氏定氮：平均含氮 16%，粗蛋白质含量=蛋白氮6.252、 氨基酸组成从化学结构上看，蛋白质是由 20 种 L-型 氨基酸组成的长链分子。3、 分类（1） 、 按组成：简单蛋白：完全由氨基酸组成结合蛋白：除蛋白外还有非蛋白成分（辅基）详细分类， P 75

2、 表 3-1，表 3-2。 （注意辅基的组成） 。（2） 、 按分子外形的对称程度：球状蛋白质：分子对称，外形接近球状，溶解度好，能结晶，大多数蛋白质属此类。纤维状蛋白质：对称性差，分子类似细棒或纤维状。（3） 、 功能分：酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。4、 蛋白质在生物体内的分布含量(干重) 微生物 50-80%人 体 45%一般细胞 50%种类 大肠杆菌 3000 种人体 10 万种生物界 1010-1012二、 蛋白质分子大小与分子量蛋白质是由 20 种基本 aa 组成的多聚物，aa 数目由几个到成百上千个，分子量从几千到几千万。一般情况下，

3、少于 50 个 aa 的低分子量 aa 多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。多于 50 个 aa 的称为蛋白质。但有时也把含有一条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。此时，多肽一词着重于结构意义，而蛋白质原则强调了其功能意义。P 76 表 3-3 （注意：单体蛋白、寡聚蛋白；残基数、肽链数。 ）蛋白质分子量= aa 数目*110对于任一给定的蛋白质，它的所有分子在氨基酸组成、顺序、肽链长度、分子量等方面都是相同的，均一性。三、 蛋白质分子的构象与结构层次蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构称为蛋白质的（天然）构象。P77 图

4、3-1，蛋白质分子的构象示意图。一级结构 氨基酸顺序二级结构 螺旋、 折叠、 转角，无规卷曲三级结构 螺旋、 折叠、 转角、松散肽段四级结构 多亚基聚集四、 蛋白质功能的多样性细胞中含量最丰实、功能最多的生物大分子。1 酶 2 结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）3 贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）4 物质运输（血红蛋白、Na +-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）5 细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）6 激素功能（胰岛素）7 防御（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白）8 接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）9 调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达

5、（组蛋白、阻遏蛋白）第二节 氨基酸一、 蛋白质的水解(见 P79)氨基酸是蛋白质的基本结构单位。在酸、碱、蛋白酶的作用下，可以被水解成氨基酸单体。酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基碱水解：消旋，色氨酸稳定酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱氨基酸的功能：（1） 、 组成蛋白质（2） 、 一些 aa 及其衍生物充当化学信号分子-amino butyric acid (-氨基丁酸 )、Serotonic(5- 羟色胺，血清紧张素 )、melatonin(褪黑激素，N-乙酰 -甲氧基色胺 )，都是神经递质，后二者是色氨酸衍生物(神经递质是一个神经细胞产生的影响第二个神经细胞或肌肉

6、细胞功能的物质)。Thyroxine(甲状腺素，动物甲状腺 thyroid gland 产生的 Tyr 衍生物)和吲乙酸(植物中的 Trp 衍生物) 都是激素( 激素就是一个细胞产生的调节其它细胞的功能的化学信号分子)。（3） 、 氨基酸是许多含 N 分子的前体物核苷酸和核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要 aa（4） 、 一些基本氨基酸和非基本 aa 是代谢中间物精氨酸、Citrulline( 瓜氨酸)、Ornithine(鸟氨酸)是尿素循不(Urea cycle)的中间物，含氮废物在脊椎动物肝脏中合成尿素是排除它们的一种重要机制。三、 氨基酸的结构与分类1809 年发现 Asp，19

7、38 年发 Thr，目前已发现 180 多种。但是组成蛋白质的 aa 常见的有 20种，称为基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸） ，还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa 经酶促修饰而来。此外还有存在于生物体内但不组成蛋白质的非蛋白质氨基酸(约 150 种)。（一） 编码的蛋白质氨基酸（20 种）也称基本氨基酸或标准氨基酸，有对应的遗传密码。近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有证据表明此氨基酸由终止密码 UGA编码，可能是第 21 种蛋白质氨基酸。结构通式：不变部分，可变部分。L-型，羧酸的 -碳上接-NH 2， ，所以都是 L- 氨基酸。-氨基酸都是白色晶体，熔点一般在 20

8、0以上。除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水，脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇和乙醚。表 20 种氨基酸结构1、 按照 R 基的化学结构分（蛋白质工程的同源替代）：（1） 、 R 为脂肪烃基的氨基酸（ 5 种）Gly、Ala、Val、Leu、Ile、图 3-2R 基均为中性烷基（Gly 为 H） ，R 基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。 （6 .00.03）P 92 表 3-7 （比较等电点。 ）Gly 是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。从 Gly 至 Ile，R 基团疏水性增加，Ile 是这 20 种 a.a 中脂溶性最强的之一（除 Phe 2.5、Trp3.4 、Tyr 2.

9、3 以外） 。（2） 、 R 中含有羟基和硫的氨基酸（共 4 种）含羟基的有两种：Ser 和 Thr。图 3-3Ser 的-CH 2 OH 基（pK a=15） ，在生理条件下不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团形成氢键，具有重要的生理意义。在大多数酶的活性中心都发现有 Ser 残基存在。Thr 中的-OH 是仲醇，具有亲水性，但此-OH 形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中心中很少出现。Ser 和 Thr 的-OH 往往与糖链相连，形成糖蛋白。含硫的两种：Cys 、Met图 3-4Cys 中 R 含巯基（-SH） ，Cys 具有两个重要性质：（1）在较高 pH 值条件，巯基离解。（2

10、）两个 Cys 的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。CysssCys二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。Cys 还常常出现在酶的活性中心。Met 的 R 中含有甲硫基（-SCH 3） ，硫原子有亲核性，易发生极化，因此，Met 是一种重要的甲基供体。 Cys 与结石在细胞外液如血液中，Cys 以胱氨酸(Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶解性最差。胱氨酸尿(Cystinuria) 是一种遗传病，由于胱氨酸的跨膜运输缺陷导致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在肾(Kidney)、输尿管(ureter)、膀胱(urinary bladder) 中结晶形成结石(Calculus, calculi)，结

11、石会导致疼疼、发炎甚至尿血。大量服用青霉胺(Penicillcemine)能降低肾中胱氨的含量，因为青霉胺与半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。青霉胺的结构（3） 、 R 中含有酰胺基团（ 2 种）Asn、Gln图 3-5酰胺基中氨基易发生氨基转移反应，转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义（4） 、 R 中含有酸性基团（ 2 种）Asp、Glu，一般称酸性氨基酸图 3-6Asp 侧链羧基 pKa（-COOH）为 3.86，Glu 侧链羧基 pKa（-COOH ）为 4.25它们是在生理条件下带有负电荷的仅有的两个 氨基酸。（5） 、 R 中含碱性基团（ 3 种）Lys、Arg 、His，一般

12、称碱性氨基酸图 3-7Lys 的 R 侧链上含有一个氨基，侧链氨基的 pKa 为 10.53。生理条件下，Lys 侧链带有一个正电荷（NH 3+） ，同时它的侧链有 4 个 C 的直链，柔性较大，使侧链的氨基反应活性增大。 （如肽聚糖的短肽间的连接）Arg 是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa 值为 12.48，生理条件下完全质子化。His 含咪唑环，咪唑环的 pKa 在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者 pKa 为 6.00，后者为7.35，它是 20 种氨基酸中侧链 pKa 值最接近生理 pH 值的一种，在接近中性 pH 时，可离解平衡。它是在生理 pH 条件下唯

13、一具有缓冲能力的氨基酸。His 含咪唑环，一侧去质子化和另一侧质子化同步进行，因而在酶的酸碱催化机制中起重要作用。（6） 、 R 中含有芳基的氨基酸（3 种）Phe、Try、Trp图 3-8都具有共轭 电子体系,易与其它缺电子体系或 电子体系形成电荷转移复合物( charge-transfer complex)或电子重叠复合物。在受体底物、或分子相互识别过程中具有重要作用。这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰，蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在 280nm处，TrpTyrPhe。Phe 疏水性最强.。酪氨酸的-OH 磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Tyr 在较高 pH 值时，酚羟基离解。Tr

14、p 有复杂的 共轭休系，比 Phe 和 Tyr 更易形成电荷转移络合物。（7） 、 R 为环状的氨基酸（ 1 种）Pro，有时也把 His、Trp 归入此类。图 3-9Pro 是唯一的一种环状结构的氨基酸，它的 -亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段 -螺旋之间的转角处，Pro 残基所在的位置必然发生骨架方向的变化， 必需氨基酸：成年人：Leu、Ile、Val、Thr、Met、Trp 、Lys、Phe婴儿期：Arg 和 His 供给不足，属半必须氨基酸。必须氨基酸在人体内不能合成，是由于人体内不能合成这些氨基酸的碳架（-酮酸）2、 按

15、照 R 基的极性性质 (能否与水形成氢键)20 种基本 aa，可以分为 4 类：侧链极性(疏水性程度)Gly 0 Ser -0.3 Glu -2.5 Lys -3.0Ala 0.5 Asn -0.2 Asp -2.5 Arg -3.0Met 1.3 Gln -0.2 His 0.5Pro 1.4 Thr 0.4Val 1.5 Cys 1.0Leu 1.8 Tyr 2.3Ile 1.8Phe 2.5Trp 3.4（1） 、 非极性氨基酸9 种，包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸氨酸、脯氨酸，这类氨基酸的 R 基都是疏水性的，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作

16、用。（2） 、 不带电何的极性氨基酸6 种，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水。酪氨酸的-OH 磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Ser 和 Thr 的-OH 往往与糖链相连，Asn和 Gln 的-NH 2 很容易形成氢键，因此能增加蛋白质的稳定性。（3） 、 带负电荷的 aa(酸性 aa)2 种，在 pH67 时，谷氨酸和天冬氨酸的第二个羧基解离，因此，带负电何。（4） 、 带正电何的 aa(碱性 aa)3 种，Arg 、Lys、His。在 pH7 时带净正电荷。当胶原蛋白中的 Lys 侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联

17、。Arg 的胚基碱性很强，与NaOH 相当。 His 是一个弱碱，在 pH7 时约 10%质子化，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。酶的活性中心：His、Ser、Cys非极性 aa 一般位于蛋白质的疏水核心，带电荷的 aa 和极性 aa 位于表面。（二） 非编码的蛋白质氨基酸也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。Prothrombin(凝血酶原)中含有 -羧基谷氨酸，能结合 Ca2+。结缔组织中最丰富的蛋白质胶原蛋白含有大量 4-羟脯氨酸和 5-羟赖氨酸。图 3-10 修饰 aa 的结构（1）4- 羟脯氨酸 （2）5- 羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤

18、维状蛋白（如胶原蛋白）中。（3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中） (4)-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有结合 Ca2+离子功能的蛋白质中。（5）Tyr 的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋白中）（6）锁链素由 4 个 Lys 组成（弹性蛋白中） 。（三） 非蛋白质氨基酸除参与蛋白质组成的 20 多种氨基酸外，生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物，它们不是蛋白质的结构单元，但在生物体内具有很多生物学功能，如尿素循环中的 L-瓜氨酸和 L-鸟氨酸。（1）L-型 氨基酸的衍生物L-瓜氨酸图L-鸟氨酸图（2）D-型氨基酸D-Glu、 D-Ala（肽聚糖中） 、D-Phe（

19、短杆菌肽 S）（3）-、-、-氨基酸-Ala（泛素的前体） 、- 氨基丁酸（神经递质） 。四、 氨基酸的构型、旋光性和光吸收1、 氨基酸的构型除 Gly 外，19 种氨基酸的 -碳原子都是不对称碳原子，因此有两种光学异构体，而 Thr 和Ile 的 -碳原子也是不对称的，因此 Thr、Ile 各有两个不对称碳原子，有四种光学异构体。图 P86 L-苏氨酸 D-苏氨酸 L-别一苏 D-别-苏构成蛋白质的氨基酸均属 L-型（L- 苏氨酸） ，大部分游离氨基酸也是 L-型。2、 旋光性20 种氨基酸中，只有 Gly 无手性碳。Thr、Ile 各有两个手性碳。其余 17 种氨基酸的 L 型与D 型互为

20、镜象关系，互称光学异构体（对映体，或立体异构体） 。一个异构体的溶液可使偏振光逆时针旋转（记为（一） ） 。另一个异构体可使偏振光顺时针旋转（计为（+） ） ，称为旋光性。光学异构体的其它理化性质完全相同。外消旋物：D-型和 L-型的等摩尔混合物。L-苏氨酸和 D-苏氨酸、L-别一苏氨酸和 D-别-苏氨酸分别组成消旋物，而 L-（D-）苏氨酸和L-（D- ）别一苏氨酸则是非对映体。旋光性物质在化学反应时经过对称的过度态时会发生消旋现象。蛋白质在与碱共热水解时或用一般的化学方法人工合成氨基酸时也会得到无旋光性的 D-、L- 消旋物。 。内消旋物：分子内消旋胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-

21、胱氨酸、内消旋胱氨酸。L-胱氨酸和 D-胱氨酸是外消旋物图 P86L-胱氨酸 D-胱氨酸 内消旋胱氨酸：（分子内部互相抵消而无旋光性）蛋白质中 L 型氨基酸的比旋光度P 87 蛋白质中 L 型氨基酸的比旋光度。氨基酸的旋光符号和大小取决于它的 R 基的性质，并与溶液的 PH 值有关（PH 值影响氨基和羧基的解离） 。3、 氨基酸的光吸收性20 种氨基酸在可见光区域无光吸收，在远紫外区（220nm 均有光吸收，在近紫外区（220-300nm）只有 Tyr、 Phe、Trp 有吸收。Tyr、Phe、Trp 的 R 基含有共轭双键，在 220-300nm 紫外区有吸收。（nm） Tyr 275 1.

22、4103Phe 257 2.0102Trp 280 5.6103 Lambert-Beer： LcTIA.lgl0五、 氨基酸的酸碱性质（重点）1、 氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在-氨基酸都含有-COOH 和-NH 2，都是不挥发的结晶固体，熔点 200-350，不溶于非极性溶剂，而易溶于水，这些性质与典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH 2）明显不同。三个现象：晶体溶点高离子晶格，不是分子晶格。不溶于非极性溶剂极性分子介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。 ）水溶液中的氨基酸是极性分子。原因：-羧基 pK1 在 2.0 左右，当 pH3.5，

23、-羧基以 -COO-形式存在。-氨基 pK2 在 9.4 左右，当 pH pKa/ 时，碱 酸pH = pKa/ 时，碱 = 酸pH 碱（2） pKa/ 就是 碱 = 酸时溶液的 pH 值，K a/就是此时溶液的H +（3）当碱 = 酸时，溶液的 pH 值等于 pKa/（4）Gly 的两性解离和滴定曲线图 3-14 Gly 的滴定曲线在 pH2.34 和 pH9.60 处，Gly 具有缓冲能力。滴定开始时，溶液中主要是 Gly+。起点：100% Gly+ 净电荷：+1第一拐点： 50%Gly + ，50%Gly 平均净电荷：+0.5第二拐点： 100%Gly 净电荷：0 等电点 pI第三拐点：

24、 50%Gly ， 50%Gly- 平均净电荷：-0.5终点： 100% Gly- 净电荷：-1第一拐点：pH=pK+lgGly /Gly+，pH=pK 1=2.34第二拐点：100%Gly ，净电荷为 0，此时的 pH 值称氨基酸的等电点 pI。第三拐点：pH=pK 2+lgGly-/Gly=pK2=9.6Gly 的等电点：等电点时：Gly-=Gly+等电点时氢离子浓度用 I 表示I2=K1K2 PI=1/2(pK1+pK2)氨基酸在等电点状态下，溶解度最小pH pI 时，氨基酸带负电荷，-COOH 解离成-COO -，向正极移动。pH = pI 时，氨基酸净电荷为零pH 2.34 正 +1

25、.0 +0.5pH=2.34 正 +0.52.349.60 负 -0.5 -1.0问题：（1）pH = pKa/ 时，缓冲能力最大，等电点时缓冲能力最小。为什么？（2）pI 的计算（氨基酸，寡肽） ，等电点时各组分的比例分析（3）不同 pH 下的组成分析和电泳行为pH pI 时，氨基酸带负电荷，-COOH 解离成-COO -，向正极移动。pH = pI 时，氨基酸净电荷为零，溶解度最小pH 10.2 -2注意：占优势离子的净电荷不是全部离子的平均净电荷。问题 1：求出二肽 LysLys 及三肽 LysLysLys 的 pI 值。图将 变成 ，就必须考虑 R 与 R（+ ，+ ，-1）等同，即侧

26、链N +H3 解离50%，此时图Lys-Lys-Lys 分子中有三个侧链可解离，它的 R+-实际相对于 R（+ ，+ ，+ ， -1 ） ，此时每个侧链解离后带有 1/3 个正电荷。问题 2：把一个氨基酸结晶加入 pH7.0 的纯水中，得到 pH6.0 的溶液，此氨基酸的 pI 值是大于 6.0？小于 6.0? 还是等于 6.0？ （小于 6.0）多肽的等电点，随着肽链内酸性氨基酸残基数的增加而下降，随着肽链内碱性氨基酸残基数的增加而上升。多肽的等电点可以通过计算求得（如上例中） ，但残基数增大时，此法不行。可将肽链内酸性残基和碱性残基进行清点比较，推测等电点偏酸还是偏碱，然后用等电点聚焦电泳

27、进行实验测定。3、 肽的化学反应和游离氨基酸一样，肽的 羧基，氨基和侧链 R 基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。图21213131三、 天然存在的活性肽生物体内存在大量的多肽和寡肽，其中有很多具有很强的生物活性，称活性肽。生物的生长、发育、细胞分化、大脑功能、免疫、生殖、衰老、病变等都涉及到活性肽。活性肽是细胞内部、细胞间、器官间信息沟通的主要化学信使。很多激素、抗生素都属于肽类或肽的生物。1、 谷胱甘肽 GluCysGly广泛存在于动、植、微生物细胞内，在细胞内参与氧

28、化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。2GSH GSSGH2O2 + 2GSH 2H2O + GSSG2、 短杆菌肽（抗生素）由短杆菌产生的 10 肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。L-OrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL-OrnL-LeuD-Phe L-ProL-Val3、 脑啡肽（5 肽）已发现几十种Met- 脑啡肽： TyrGlyGlyPheMetLeu-脑啡肽： TyrGlyGlyPheLeu具有镇痛作用。1982 年，中科院上海生化所用蛋白质工程技术合成了 Leu-脑啡肽，既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。神经生物

29、化学 神经多肽生物体内多肽或寡肽的来源：合成蛋白质的剪切、修饰酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽） 、动物肠道可吸收寡肽第四节 蛋白质的一级结构（共价结构）蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。一、 蛋白质结构层次一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构） 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序二级结构超二级结构构象（高级结构） 结构域三级结构(球状结构)四级结构(多亚基聚集体)一级结构：共价结构、蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)二级结构：多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。主要有 -螺旋、 折叠、-转角、无规卷曲。超二级结构：由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级

30、结构的组合体如、。结构域：大的球蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由 100-200 个氨基酸残基构成。三级结构：多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的借各种次级键维持的球状构象。或：蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，不含亚基间或分子间的空间排列关系。四级结构：寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。RNase单条肽链 肌红蛋白单体蛋白 胰岛素多条肽链 胰凝乳蛋白酶蛋白质 相同亚基 一种乳酸脱氢酶 4寡聚蛋白 不同亚基 血红蛋白 2 2蛋白质一级结构

31、(序列) 中含有形成高级结构的全部需的信息，一级结构决定高级结构结构及功能。二、 一级结构的要点蛋白质主链由氨基酸以酰胺键连接，多肽的线性结构叫肽链，组成肽链的氨基酸叫氨基酸残基。一级结构要点：蛋白质中的肽键都是由 -NH2 和 -COOH 结合生成的。每一种蛋白质都有相同的肽主链结构，各种蛋白质间的差异是蛋白质的氨基酸种类、数量及排列顺序不同。氨基酸的 -NH 2 和 -COOH 缩合，只有末端及侧链基团有化学活性。每个蛋白质或每个蛋白质的亚基只有一个 -NH 2 和 -COOH分子量大于 5000 的活性肽才能称为蛋白质。 三、 蛋白质一级结构测定推断 预测氨基酸序列（一级结构） 空间结构

32、 （高级结构） 功能 （一） 蛋白质测序的一般步骤祥见 P116（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。（2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。（3） 测定多肽链的氨基酸组成。（4） 断裂链内二硫键。（5） 分析多肽链的 N 末端和 C 末端。（6） 多肽链部分裂解成肽段。（7） 测定各个肽段的氨基酸顺序（8） 确定肽段在多肽链中的顺序。（9） 确定多肽链中二硫键的位置。（二） 蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从 N 端直接测至 C 端，但目前只能测 60 个 N 端氨基酸。1、 直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法N CA 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B

33、2 B3 B4 用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。2、 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）核酸测序，一次可测 600-800bp（三） 测序前的准备工作1、 蛋白质的纯度鉴定纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。 （两种以上才可靠）聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带DNScl（二甲氨基萘磺酰氯）法测 N 端氨基酸2、 测定分子量用于估算氨基酸残基 n=方法：凝胶过滤法、沉降系数法3、 确定亚基种类及数目多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：非共价键结合8mol/L 尿素，SDS SDS-PAGE 测分子

34、量 二硫键结合过甲酸氧化：SS+HCOOOH SO3H 巯基乙醇还原：举例:： 血红蛋白 ( 2 2) （注意，人的血红蛋白 和 的 N 端相同。 ）分子量： M拆亚基： M1 、M 2 两条带拆二硫键： M1 、M 2 两条带分子量关系： M = 2M1 + 2M24、 测定氨基酸组成主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。确定肽链中各种 a.a 出现的频率 ,便于选择裂解方法及试剂。Trp 测定对二甲基氨基苯甲醛 590nm。Cys 测定5、5 /一二硫代双（ 2硝基苯甲酸）DTNB ，412nm5、 端基分析N 端分析DNS-cl 法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多

35、肽水解后的 DNS-氨基酸不需要提取。DNFB 法：Sanger 试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色 DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等PITC 法： Edman 法，逐步切下。无色 PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。C 端分析A肼解法H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼 NH2NH2 100 5-10h。A-NHNH2 、 B-NHNH2 、 C-NHNH2 、 D-COOH氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C 端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg 不能用此法。B羧肽酶法（Pro 不能测）羧肽酶 A：除 Pro、Arg、Lys 外的所有 C 端 a.a

36、羧肽酶 B：只水解 Arg、LysN H2N ValSerGly C10mw图 P118 羧肽酶法测 C 末端（四） 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化1、 化学裂解法溴化氰 MetX 产率 85%亚碘酰基苯甲酸 TrpX 产率 70-100%NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）XCys羟胺 NH2OH AsnGly约 150 个氨基酸出现一次2、 酶法裂解胰蛋白酶 Lys X(X Pro) Arg X胰凝乳蛋白酶 TyrX(X Pro) TrpXPheX胃蛋白酶Phe(Trp、 Try、 Leu)Phe(Trp、 Try、 Leu)Glu 蛋白酶 GluX（V 8 蛋白酶）Arg 蛋白酶 Arg

37、XLys 蛋白酶 XLysPro 蛋白酶 ProX3、 肽段的分离纯化电泳法 根据分子量大小分离离子交换层析法（DEAECellulose、DEAE Sephadex）根据肽段的电荷特性分离反相法根据肽段的极性分离凝胶过滤4、 肽段纯度鉴定分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用c l 法要求：单带、单峰、端单一。（五） 肽段的序列测定及肽链的拼接1、 Edman 法一次水解一个端 a.a（1）耦联PITC H NA-B-C-D pH89 ， 40 PTCA-B-C-D（2）裂解PTCA-B-C-DTFA 无水三氟乙酸 ATZA + H2NB-C-D（3）转化ATZA PTHA用 GC 或

38、HPLC 测定 PTH-APTC 肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）耦联：得 PTC 肽一次循环 裂解：ATZ- a.a转化：PTH-a.a反应产率 99 循环次数 120(偶联、降 98% 60解两步） 90% 402、 DNS-Edman 法用 DNS 法测 N 末端，用 Edman 法提供（n-1）肽段。肽图3、 有色 Edman 法荧光基团或有色试剂标记的 PITC 试剂。4、 用自动序列分析仪测序仪器原理：Edman 法，可测 60 肽。1967 液相测序仪自旋反应器，适于大肽段。1971 固相测序仪表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽

39、段的端。1981 气相测序仪用 Polybrene 反应器。（聚阳离子）四级铵盐聚合物液相：5nmol 20-40 肽 97%气相：5pmol 60 肽 98%5、 肽段拼接成肽链16 肽，端 H 端法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT法裂解：SEO WTON VERL APS HO重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS（六） 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定1、 二硫键的确定（双向电泳法）碘乙酰胺封闭-SH胃蛋白酶酶解蛋白质第一向电泳过甲酸氧化S S生成 -SO3H第二向电泳分离出含二硫键的两条短肽，测序与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。2、 酰胺的确定Asp A

40、sn、Glu-Gln酶解肽链，产生含单个 Asx 或 Glx 的肽，用电泳法确定是 Asp 还是 Asn举例：Leu-Glx-Pro-Val 肽在 pH=6.0 时，电荷量是 Leu+ Pro0 Val-此肽除 Glx 外，净电荷为 0，可根据此肽的电泳行为确定是 Glu 或是 Gln。3、 糖、脂、磷酸基位置的确定糖类通过 Asn、Ser 与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷脂类：Ser 、 Thr、Cys磷酸：Ser 、 Thr、His经验性序列： Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg) Ala-Ser(PO4)四、 蛋白

41、质的一级结构与生物功能（一） 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能蛋白质一级结构举例：（1） 牛胰岛素Sanger 于 1953 年首次完成测序工作。P128 图 3-38 分子量：5700 dalton51 个 a.a 残基，A 链 21 个残基，B 链 30 个残基，A 链内有一个二硫键 Cys 6Cys 11A.B 链间有二个二硫键 A.Cys 7 B Cys 7A.Cys 20B Cys 19（2）核糖核酸酶（RNase）P128 图 3-39分子量：12600124 个 a.a 残基4 个链内二硫键。牛胰 RNase 变性一复性实验：P164 图 3-69。(8M 尿素+ 硫基乙醇)变

42、性、失活透析，透析后构象恢复，活性恢复 95%以上，而二硫键正确复性的概率是 1/105。（3）人血红蛋白 和 链及肌红蛋白的一级结构 P129 图 3-40（二） 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。同源蛋白质的特点：多肽链长度相同或相近同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋

43、白质的功能。通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。1、 细胞色素 C存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。P130，图 3-41分子量：12500 左右氨基酸残基：100 个左右，单链。25 种生物中，细胞色素 C 的不变残基 35 个。60 种生物中，细胞色素 C 的不变残基 27 个。亲源关系越近的，其细胞色素 C 的差异越小。亲源关系越远的，其细胞色素 C 的差异越大。人与黑猩猩 0人与猴 1人与狗 10人与酵母 442、 胰岛素祥见 P175 胰岛素的结构与功能不同生物的胰岛素 a.a 序列

44、中，有 24 个氨基酸残基位置始终不变，AB 链上 6 个 Cys 不变（重要性） ，其余 18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。其它氨基酸 对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。（三） 蛋白质一级结构的个体差异分子病分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。Linus Pauling 首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，成人的血红蛋白是由两条相同的 链和两条相同的链

45、组成 22，镰刀形红细胞中，血红蛋白链第 6 位的 aa 线基由正常的 Glu 变成了疏水性的 Val。因此，当血红蛋白没有携带 O2 时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用(血细胞溶解)导致病血，棍棒形的血红蛋白对 O2 的结合力比正常的低。以血红蛋白为例： 2 2 寡聚蛋白正常人血红蛋白，.NGlu 6镰刀型贫血 .NVal 6生理条件下电荷：Va10 Glu-疏水 亲水人的血红蛋白分子的四条肽链中（574 个氨基酸残基）只有两个 Glu 分子变化成 Va1 分子，就能发生镰刀状细胞贫血病。（四） 一级结构的部分切除与蛋白质的激活一些蛋白质、酶、多肽激

46、素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。1、 血液凝固的机理凝血因子（凝血酶原致活因子）凝血酶原 凝血酶纤维蛋白原 A 纤维蛋白 B 凝胶（1） 、 凝血酶原P133 图 3-43 凝血酶原的结构糖蛋白，分子量 66000，582 个 a.a 残基，单链。在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的 Arg274Thr275 和 Arg323Ile324 断裂，释放出 274 个 a.a，产生活性凝血酶。A 链 49 a.aB 链 259 a.a（2） 、 纤维蛋白原P133 图 3-44 纤

47、维蛋白原的结构 2 2r2 肽：600 个氨基酸， 肽：461 氨基酸，r 肽：410 个氨基酸在凝血酶作用下，从二条 链和二条 链的 N 端各断裂一个特定的肽键 -ArgGly-，释放出二个纤维肽 A（19 个氨基酸）和二个纤维肽 B（ 21 个氨基酸） ，它们含有较多的酸性氨基酸残基。P133 纤维肽 A .B 的结构A、B 肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。P134 上在凝血因子 XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys 结合） ，生成交联的纤维蛋白。2、 胰岛素原的激活P134 图 3-45胰岛素在胰岛的 细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除 C 肽，得到活