1、寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上 6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用 - 32PATP在 T4多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A260单位的寡核苷酸。取 1 g已标记了的寡核苷酸
2、与 20单位的内切酶，在 20C条件下分别反应 2小时和 20小时。反应缓冲液含 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的 NaCl或 KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。DNA 合成，新链的延伸方向是 53 因此，需要在 5 端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个 platform 让它可以结合上去，否则会掉下来. 引物
3、的结构就是（53 ）：保护碱基+ 酶切位点 +原来的引物序列首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变切割率%酶 寡核苷酸序列 链长2 hr 20 hrAcc I GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl III CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 90 900 90 90Asc I GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 1290 90 9090 90 90
4、Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 90 9090 90 90BamH I CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 90 9025 90 90Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 90 90BssH II GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 90BstE II GGGT(A/T)ACCC 9 0 10BstX I AACTGCAGAACCAATGCATTGG
5、AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24 270 25 250 50 90Cla I CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 90 500 0 90 50EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 1290 90 9090 90 90Hae III GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 1290 90 9090 90 90Hind III CAAGCTTG CCAAGCTTGG
6、 CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn I GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 90 900 90 90Mlu I GACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco I CCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde I CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC 8 10 12 18 0 0 0 0 0 0 0 0 GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC20
7、2275 7590 90Nhe I GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not I TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 90Nsi I TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT12 2210 9090 90Pac I TTAATTAA GTTAATTA
8、AC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 90Pme I GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 90Pst I GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24 260 10 90 90 00 10 90 90 0Pvu I CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATC
9、GCGA8 10 120 10 00 25 10Sac I CGAGCTCG 8 10 10Sac II GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 90Sal I GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca I GAGTACTC AAAAGTACTTTT8 1210 7525 75Sma I CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 1
10、20 0 10 9010 10 50 90Spe I GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410 10 0 090 90 50 50Sph I GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu I AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 1290 90 9090 90 90Xba I CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 90 75 750 90 90 90Xho I CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG8 10 120 10 100 25 75Xma I CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA8 10 12 140 25 50 900 75 90 90DNA 合成，新链的延伸方向是 53 因此，需要在 5 端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个 platform 让它可以结合上去，否则会掉下来. 引物的结构就是（53 ）：保护碱基+ 酶切位点 +原来的引物序列
