1、E h b_ _/ . h _季阳 郑忠伟 蔡辉 肖小璞 苑宇哲(SD SxD , +610081)1oM:输血;传染病;病毒;血清学检测;核酸检测;HIV;HCV;HBVms |:R446.61 Q503 DS M :A cI|:1004-549X(2010)06-0413-05最近 30多年,随着科学技术的迅速发展,输血传染病(或输血传播的疾病)筛检方法与技术也取得了长足进步,对保障输血安全、预防控制输血传染病的传播起到非常重要的作用。输血传染病的筛检方法与技术的进步主要表现在病毒血清学(抗体、抗原)检测方法与技术的不断升级换代,提高了检测的灵敏度和特异性,还表现在病毒核酸检测技术(NAT
2、)的引入和不断改进。现就血液筛检中病毒血清学技术与NAT的应用现状及及今后的发展做一评述。1 . h b_/ 人们很早就注意到曾患上某种传染病的患者痊愈后,对该传染病便具有了不同程度的免疫力。 19世纪末至 20世纪初,许多科学家相继发现了免疫血清在体内和试管内可以凝集、溶解和杀灭细菌,血清与相应微生物或毒素反应的物质统称为抗体,引起抗体产生的刺激物质(细菌、病毒、细胞、毒素等)称为抗原。自此体外抗原抗体反应的研究作为免疫学的 1个分支血清学形成,它对于病原的鉴定和传染病的诊断起到了相当重要的作用。目前我国规定的对献血者和血液制品进行输血相关传染病标志物检测的方法,就是利用免疫血清学抗原抗体产
3、生的原理,检测的项目有HB-sAg、抗-HCV、抗-HIV、梅毒和ALT,均为血清学检测方法。1.1 HBsAg HBsAg原称澳大利亚抗原, 1965年由Blum-berg等首先报道;1967年Krugman等发现澳大利亚抗原与肝炎相关,故又称“肝炎相关抗原”。这是乙型肝炎患者血液中特有的 1种抗原性物质,在电子显微镜下观察,乙肝抗原有 3种形态,即小球形、管形和完整的Dane颗粒;后来的研究证实,Dane颗粒是 1种完整的HBV,而小球形与管形颗粒是HBV在肝细胞内复制过程中过剩的外壳,即乙肝表面抗原(HBsAg)。一般认为,HBsAg无感染性,但在血清中含量比Dane颗粒高数千倍,HBs
4、Ag的出现代表了HBV复制,所以测定HBsAg对确定血液中是否含有HBV具有重要价值。 1979年Galibert测定了HBV全基因序列,进一步揭示了HBV基因的结构。1.1.1 HBsAg检测方法 自HBsAg检测方法在 20世纪 70年代建立以来,经过不断地换代、更替,由最初的琼脂扩散法,到对流免疫电泳法、反向被动血凝法(检测HBsAg的灵敏度分别为 1 000、100、10ng/ml),直至 20世纪 80年代推出固相放射免疫测定法和酶联免疫吸附法(ELISA法),尤其是ELISA法在技术上地持续改进,使其检测灵敏度与特异性不断增强目前市售ELISA试剂检测HBsAg的敏感度已达到(0.
5、1 0.5)ng/ml(血清);而一些先进国家已开始应用更加敏感的化学发光免疫法并应用NAT技术检测HBV-DNA。1.1.2 HBsAg阳性的确证方法 由于我国一般人群中HB-sAg携带率较高,所以对乙肝与HBV感染的诊断和防治颇受公众关注。当ELISA法检测HBsAg为阳性反应时,确证方法是用抗体中和法,辅助确证方法是HBV-DNA测定。人们近来发现,用ELISA法检测大样本量的HBsAg时,总是存在少部分漏检的标本,造成这一问题的原因已经弄清,主要是HBV感染检测的“窗口期”、HBV变异、免疫静默感染和人为实验操作错误所致。ELISA检测HBsAg漏检率国外资料报道为 1/6.3万,如果
6、增加NAT检测可将输血传播HBV的风险度进一步降低。1.2 抗-HCV HCV是 1989年经分子克隆技术发现的,Choo等从受感染的黑猩猩血液标本中建立cDNA文库,从约100万个克隆中找到 1个与本病恢复期血清起阳性反应的克隆(5-1-1),将其在酵母中表达的蛋白称为C-100,用以检测非甲非乙型肝炎恢复期血清获得成功。同年东京国际非甲非乙型肝炎会议正式命名此新发现的病毒为HCV,随后抗-HCVELISA试剂问世。1.2.1 抗-HCVELISA法检测 自第 1代HCVELISA试剂问世至今已经历了 4代1。第 1代试剂只含有C-100重组蛋白,第 2代试剂含重组Core、NS3和NS4重
7、组蛋白或合成肽,第 3代试剂则较第 2代增加了NS5,第 4代试剂又增加了检测核心抗原的成分。由于抗-HCV检测试剂所用抗原比较复杂,同时人体针对试剂中这些抗原成分的特异性抗体的出现与持续时间又不一致,因此试剂中的HCV多种抗原的质量与浓度配比就显得十分重要,而且还要考虑HCV亚型的问题。我们在检测血液标本时应尽可能采用 2种以上厂家生产的试剂,以互补不足。第 4代试剂是HCV抗体与抗原联合检测,理论上可缩短检测的“窗口期”,但同时检测抗原与抗体会不会干扰抗体检测的灵敏度,是人们担心的问题,所以大部分采供血机构、临床机构目前主要还是使用第3代HCVELISA试剂。1.2.2 HCV感染的确证试
8、验 在低危人群中作抗-HCV检测常会发生许多假阳性结果。我国 1992年的 1项对全国 30个省、市、自治区 22 961个家庭 67 185人的血清流行病调查结果显示, 抗-HCV标化后全国流行率平均为 3.2%(0.9% 5.1%),即约有 4 160万人感染HCV。但由于当时413S 2010 M623 6 ChinJBloodTransfusionJune, 2010,Vol.23,No.6条件的限制均没做HCV确证试验,不能排除其中一些抗-HCV假阳性结果。当今国际上对HCV感染的确证试验主要采用的是RIBA法,RIBA试剂的检测结果可能有 3种:阳性、不确定(可疑)和可疑;对不确定
9、的结果需继续进行追踪观察,弄清这些“不确定结果”最终是转为“阴性”还是转为“阳性”,如果能加作HCV-RNA检测作为辅助诊断则更好。1.3 抗-HIV HIV是引起艾滋病的病原体,首次于 1983年发现。1.3.1 抗-HIVELISA法检测 1985年第 1代HIVELISA检测试剂问世,试剂所用HIV抗原来自病毒裂解产物;随后使用重组抗原与合成肽抗原的第 2、3代试剂问世,二者的区别在于第 2代试剂为间接法,第 3代试剂为双抗原夹心法;第 4代试剂增加了p24抗体和O亚型抗体成分,即除了能检测抗-HIV外,还能同时检测HIV-1p24抗原和O亚型感染2;从第 2代开始,试剂中均增加了对HI
10、V-2型的检测。理论上第 4代HIVELISA试剂检测的“窗口期”(约 16 18d)比第 3代的“窗口期”(约 22d)缩短 5 6d,但是第 4代试剂将HIV的抗体、抗原同时检测,会不会影响检测抗-HIV的敏感性令人担心。然而也已有报告说明第 4代试剂增加HIV-1p24抗原检测不会影响抗体测定的敏感性。美国血站与输血机构标准17版(1996年)至 21版(2002年)规定了增加HIV-1p24抗原检测,后发现成本费增加而收效甚少,其效果不及增加核酸检测项目,所以从第 22版(2003年)开始,删去了HIV-1p24抗原检测,增加HIV-1RNA和HCVRNA2项检测3。这说明即便美国这样
11、的发达国家,对是否使用第 4代HIVELISA试剂仍有明显分歧。1.3.2 抗-HIV阳性标本的确证试验 ELISA检测抗-HIV阳性反应标本中有相当大的一部分为假阳性,必须做确证试验。采供血机构对ELISA抗-HIV初筛阳性反应的标本应当用原试剂加另一不同厂家试剂复查,如果复查有 1份或 2份标本呈阳性反应,就应当送HIV确证实验室做确证试验;但为了确保输血安全,无论确证试验结果如何(即使后来WB检测为阴性),只要是ELISA检测阳性,该份标本所属的血液就不能发往临床应用。我国已明确规定ELISA抗-HIV阳性或快速试验阳性结果不能直接报告,必须经相关HIV确证实验室使用免疫印迹试验(WB)
12、确证,确证结果可能为:阴性、不确定(可疑)和阳性 3种。对“不确定”者的处理,应结合流行病学资料,在 4周和 8周后对其随访检测,如随访期间带型呈阴性反应,则报告阴性;如随访期间出现阳性反应,则报告阳性;如随访到 8周,带型仍旧无进展,则报告阴性;如有变化但不满足阳性判断标准,则视情况决定是否继续随访。另外,可做NAT、p24抗原检测来辅助确证。1.4 梅毒 如果献血者血液中存在梅毒螺旋体,当其血液输给患者时可使后者发生二期梅毒疹。 20世纪 40年代,经过一些学者试验证明,梅毒螺旋体在冷藏(4 6)血液中贮存 3d或在冷冻(-20)血浆中贮存 2d,就不再具有传播梅毒的危险。近 30多年来极
13、少见有输血传播梅毒的报告,但是仍不能忽视对梅毒的检验,因为新鲜血液和新鲜血小板没有经过 3d冷藏,仍有可能传播梅毒。检测梅毒的方法在 20世纪 4070年代主要是使用康瓦氏试验,其敏感性与特异性均较差;20世纪 80年代后,不加热血清反应素试验(USR)、快速血浆反应素试验(RPR)和甲苯胺红快速血浆反应素试验(TRUST)投入梅毒检测,近 10年来又发展了TP-ELISA试验,检测的敏感性与特异性不断提升。梅毒试验的确证试验有梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)、梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)和荧光螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)。USR、RPR和TRUST方法都是非特异性检测方法,它们对
14、于观察临床治疗梅毒效果具有重要价值;而ELISA、TP-PA、TPHA、FTA-ABS均为特异性检测方法,检测的是梅毒特异性抗体,对于了解是否感染过梅毒有重要价值,而且梅毒特异性抗体不因梅毒治疗而很快消失。比较而言,在各种对献血者进行血液梅毒检测的方法中,ELISA比较敏感和特异,建议我国今后在修订献血者健康标准时弃用RPR、USR和TRUST等非特异性试验,而选择使用ELISA方法。1.5 ALT ALT是在许多组织细胞中存在的 1种酶,在肝细胞中浓度最高,因而被当做检测肝炎的非特异性试验指标。当人体发生病毒感染、胆道疾病、药物中毒、酒精中毒、血色素沉着症和肥胖引起肝持续损害时,可引起ALT
15、升高4。我国对献血者规定做ALT常规检测起始于 20世纪70年代ALT检测方法问世以后。急性肝炎患者的ALT水平往往很高,可代表其肝功能受损,但慢性肝炎患者不一定ALT水平都异常。现在世界各国对于献血者是否要做ALT检测存在较大争议,缘起美国AABB血站与输血机构标准(第 17版, 1996年)取消了对献血者的ALT常规检测项目。ALT检测对控制肝炎传播有无意义,在学者中尚存在争议4,5:赞成取消ALT检测者的理由是ALT检测方法是 1种非特异性肝功检测方法,ATL水平生理波动性大,而现时乙肝与丙肝的检测已有了灵敏度更高的方法;反对取消ALT检测者的理由也很充分,如ALT异常除肝脏疾病外,还可
16、能同其它疾病有关,ALT水平异常出现的时间早于肝炎病毒抗体出现的时间,故可能减少血液筛查中漏检HCV“窗口期”感染和HBV隐匿性感染的风险。实际上即便在美国,虽然AABB取消了献血者的ALT筛查项目,但目前仍有一些血站在继续做ALT筛查6。对此问题,我国许多学者也做了不少研究和分析(中国输血杂志亦曾多有报道)。献血者筛查中ALT检测不合格的比例较高的原因很可能是ALT水平生理波动较大,比如某次检测ALT值25U(哪怕刚超过一点)就会判不合格。还有一个重要原因是我国现在规定的献血者“ALT合格标准”(赖氏法95%13;我们要充分评估多份标本混合后对检测的灵敏度与特异性的影响,一般对血液成分制品的
17、筛查可参考美国标准,血液标本汇集不宜超过 8或 16份,对生产血浆蛋白制品的原料血浆标本汇集数,也应当制定一个适当限度,当然,标本的汇集份数的限定,主要取决于试剂的灵敏度;第四是对NAT检测人员的技术水平、设备、环境条件都要求很高,现在有些国家实行标本集中化检测,其优点很明显,但在我国要实施标本集中化检测,还存在许多实际问题,有待试点和妥善解决。3 h b_NAT T当人体发生细菌、病毒感染后,可使用血清学和NAT来检测血液,了解疾病进展情况。这 2种技术各有优缺点,不能互相代替,我们应当充分利用两者优势互补作用,来进行疾病诊断、病情监测和治疗效果的观察,以及判断预后。现列举HIV、HBV、H
18、CV、梅毒感染检测说明如下:3.1 HIV检测 HIV感染后 1 2周(11d)内可检则到HIVRNA,接着于 3 4周(22d)可检测到抗-HIV(第 3代ELISA试剂),必须这两者具备或检测到抗体(经过确证)才能诊断HIV感染;如果只是HIVRNA阳性,而不出现抗-HIV阳性,则应考虑HIV-RNA检测是否准确,因为HIV-RNA检测也可能出现假阳性。然而,抗-HIV检测技术是比较成熟、稳定的,发生HIV感染后,尽管抗-HIV出现前的“窗口期”较长,但终归会出现的,查不出抗-HIV的情况几乎没有,故目前HIV感染初期的检测仍以抗-HIV检测为主,HIVNAT为辅。此外,检测HIV-RNA
19、水平可以监测HIV感染的进程和治疗效果,而抗-HIV由于是免疫性和病理性抗体,终身存在,不能监测治疗效果,但HIVRNA测不出不能说明HIV感染已经消失,因为HIV还存在于人体的CD4淋巴细胞和其他细胞、组织、器官中,而且在停止用药治疗后,HIVRNA水平还可能反弹,所以抗-HIV阳性(经确证)在目前还是我国诊断HIV感染的主要指标。但我们也应注意,在艾滋病晚期抗-HIV可能减弱,这时应结合病程判断。3.2 HCV检测 HCV感染后 1 2周(平均 12d)可检测到HCVRNA,于 2 3个月(平均 70d)可检测到抗-HCV(第 3代ELISA试剂),HCVRNA载量检测可以监测HCV感染的
20、疾病进程和治疗效果,但HCVRNA测不出不能完全代表疾病痊愈,因为HCVRNA在疾病治疗过程中或自然进程中有时呈现低水平,检测结果出现时阴时阳现象,在经过治疗后可能HCVRNA载量减低乃至测不出,在停药后又可能反弹。已有文献报告,HCV感染一旦发生,抗-HCV就长期存在,且一经产生就不易消失14。部分HCV感染者,疾病可自然痊愈,HCVRNA也随之消失,但其抗-HCV可长期存在或只是减弱(RIBA试剂检测表现为“不确定”结果),因为在低危人群(如献血人群)中抗-HCVELISA检测呈阳性反应时可能为假阳性结果,故应当做确证试验。由于抗-HCV确证试剂(RIBA试剂)价格昂贵,美国提出 1种确证
21、替代试验:用Ortho公司第 3代HCVELISA试剂或Abbot公司第 2415S 2010 M623 6 ChinJBloodTransfusionJune, 2010,Vol.23,No.6代HCVELISA试剂检测,如S/CO值3.8时,可以预测95%抗-HCV阳性为真阳性。但国产试剂灵敏度各厂家之间差别较大,而且有些厂家试剂的灵敏度不够稳定,所以目前国内如使用此替代策略来替代确证试验是有困难的。3.3 HBV检测 HBV感染后 2个月(平均 56d)可检测出HBsAg,这是最早出现的HBV感染标志,它早于抗-HBc、抗-HBe和抗-HBs的出现;HBV感染后最早 33d可检测出HBV
22、DNA2。由于HBV复制周期较长,所以HBVDNA检测的“窗口期”同HBsAg检测的“窗口期”相比,缩短的时间并不理想,加上现在HBsAg检测的灵敏度还在不断提高,所以一些国家不急于开展HBVNAT检测。但由于NAT终究还是可以缩短HBVDNA检测“窗口期”,加之现在发现有些隐匿性HBV感染者的血清检测HBsAg为阴性,所以现在还是有越来越多的国家主张对献血者开展HBVNAT检测。3.4 关于输血传播感染的风险度评估 目前对输血发生HIV、HBV、HCV感染的风险度估计是建立在ELISA检测血液标本为阴性的基础上,再做NAT可发现少数阳性结果,或献血者献血时处于检测“窗口期”,以后被发现为感染
23、者。总体上说,由于血液筛检技术的进步,现在输血风险性在不断降低。美国报告NAT检测前的输血风险度:HIV为 1/70万、HCV为 1/10万、HBV为 1/6.3万;对HIV和HCV感染开展NAT后均为输血传播风险度 , g l ,.h _DA ,_D, 2004, 27(9):596-599.10 f ,+, ),. _/ ,_D.2009, 22(6):469-470.11 IY, . , ,. _A #+.S , 2009, 22(2):130-131.12 ,1.A h _Z.S= #A, 2010, 3(2):189-190.13 t ,f i. _/ Ah #B . “5 _, 2
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27、010)06-0417-03“/%M(haematopoieticstemcelltransplan-tation,HSCT) 7Z, sWM - 594 。 5 ? sWM H 1 p, z L /%M- ,A S SD 3# M M1 M。1 /%M sW 1v15% 30%sy/%M(alo-HSCT)sW%ABO, sWABO/%M F h(GVHD)? 3iY。 sWABOc3 f :1)ABO1(v), s8 =i FABOF “ , AO(A、 sO)、BO、ABO、ABAABB;2)ABOQ1(l), 8 =i F sABO F“ , OA、OB、OAB、AABBAB;3)AB
28、O1#Q1 Hi, s8 =i FABO F “ , H8 =9iF sABO F “ , AB、BA。“ sABO f ,HSCT sW V ?i %“d,1 Rh、MNS、KelKidd, K1 sWRh, :1)Rh1,Rh(+)、 sRh(-);2)RhQ1,Rh(-)、 sRh(+)。2 sW/%M HM N513 sWHSCT H,M N /5:1)E ? 3$ i;2) V ? F8, _;3) M 5。 5N Hi KD4。ABO1AO : sO、A, sA -,l KD4 A,7dO,yOl c FA% “ , sO_A。 Ol 9 ,dKD4;7N H Al ,yl +c%s,? 3 Q。ABOQ1OA : sA、O, sO -,%A KD4 O!%A,7dA%A,y % , “ % ?,% 3 FA% “ ,N H T A%, 5, 9F iB;7 O!%A5 B,T n。3 sWABO H/%M - 143.1 sWABO1HSCT3.1.1 HSCT -M s) T s8 = F417S 2010 M623 6 ChinJBloodTransfusionJune, 2010,Vol.23,No.6
