1、生物化学实验报告蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法- 1 -蛋白质浓度测定考马斯亮蓝染色法（实验报告）实验日期：2015 年 4 月 28 日 实验温度：室温实验地点：生物化学与遗传学实验室 指导老师：*班级：2013 级生物技术 1 班 姓名：* 学号：* I. 实验目的1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。II. 实验原理考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。考马斯亮蓝 G-250 在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长 465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长 595nm
2、，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 结合，反应 2min 即可到达平衡，复合物在室温下 1h 内保持稳定。蛋白质考马斯亮蓝 G-250 复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。III. 实验试剂与仪器1.实验试剂生物化学实验报告蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法- 2 -(1) 100g/mL标准蛋白质溶液 5mg 酪蛋白溶于 50mL的 0.1mol/L 氢氧化钠溶液 。(2)考马斯亮蓝 G-250 试剂 50mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 25mL 的 95%乙醇中，加 85%的磷酸 50mL，蒸馏水定容至
3、500mL。(3)正常人血浆。2.实验器材可见分光光度计，100L 微量移液器 16 支，5mL 刻度吸管 8 支，中试管。IV. 实验操作步骤1.绘制标准曲线 取中试管 8 支，按下表加入各种试剂混匀，室温放置 5min 后即可比色。以“0”号管为空白，记录于下表，绘制标准曲线。标准曲线绘制数据表0 1 2 3 4 5 样 1 样 2mL 0 1 2 3 4 5 样品1样品 2标准蛋白质溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 - -血浆 0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.4 0.40.1mol/LNaOH - - - - - - 0.6 0.6考马斯亮蓝试剂 各 5.0生
4、物化学实验报告蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法- 3 -标准蛋白 g数0 20 40 60 80 100A595 0 0.517 0.805 0.941 1.157 1.192 1.465 1.4402.样品测定 中试管 2 支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL，各加 5.0mL 考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置 5min，以“0” 号管为空白比色，以所测 A595 于标准曲线查蛋白质含量。V. 实验结果分析结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为：血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；实验比色杯由于使用后未及时擦洗，导致比色误差（原因小）；人为操作不当，导致误差。VI. 注意事项1. 考马斯亮蓝试剂加入后室温放置 520min 内比色，生物化学实验报告蛋白质浓度测定:考马斯亮蓝染色法- 4 -布的超过 1h；2. 蛋白质-染料复合物少量附于比色杯，不影响测定，可用乙醇洗净。
