1、姓名： 王彬安时间： 2017年 06月 15日高通量 建库 测序 +数据拆分文库构建 ( 6 hrs)cBotHiSeq xTenMiSeqCluster簇生成 ( 5 hrs)HiSeqMiSeqSBS测序数据分析 bcl2fastqDNA文库构建流程 片段化 DNA末端补平3加 A接头连接PCR高质量 DNA文库结构文库构建的目的是在目的 DNA片段两端都连接上想要的接头此单链部分与FlowCell表面上 P7接头相同此单链部分与FlowCell表面上 P5接头相同Index Sequencing PrimerHiSeq测序用到的引物Multiplexing Read 1 Sequenc
2、ing Primer 5 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT Multiplexing Index Read Sequencing Primer 5 GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACMultiplexing Read 2 Sequencing Primer 5 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT FlowCell上的接头P7接头序列5 sttttttttttcaagcagaagacggcatacga 3OHOHs(T)10aatgatacggcgaccaccga 3P5接头序列SRFC这是 Si
3、ngle Read FC 接头，因为找不到Paired End FC接头，但是 红色部分序列两种 FC是相同的，只是修饰位点不同而已P5P7测序芯片 (Flow Cell)简介flow cell是有 2个或 8个泳道 (Lane)的玻璃片，与一元硬币的厚度相当每个泳道 (Lane)内的上下两个表面随机的布满了能够与文库两端接头分别互补配对的寡核苷酸 (oligos,P7和 P5接头 )在 flow cell上进行 cluster簇生成仪器简介单条 DNA 模板约 1000条DNA模板的拷贝cBot HiSeq Sequencer35个循环的桥式 PCRcBot 工作流程DNA文库变性：使用 N
4、aOH将双链 DNA文库变性为单链模板链杂交： 将单链 DNA模板杂交到 Flow Cell 上第一链合成： 以 Flow Cell 表面上的 oligos为引物，合成第一链桥式 PCR： 冲走单链 DNA模板，以合成的第一链为模板进行 35循环的桥式 PCR线性化： 将与 P5接头连接的 DNA链从 Flow Cell 上去除阻断 3 OH： 防止在后续测序过程中继续延伸 DNA链杂交测序引物DNA模板杂交和一链合成 接头序列5-3 延伸含有 P7和 P5两种接头的 FlowCell表面单链 DNA分子与 FlowCell表面的对应接头杂交以杂交的单链 DNA为模板，FlowCell上的接头
5、为引物，合成第一链新合成的链原始模板链双链 DNA变性丢弃原始模板链变性模板链被冲洗走新合成的链留在 FlowCell上桥式 PCR扩增单链 DNA与 FlowCell表面对应接头杂交，形成“桥”以接头为引物进行扩增扩增完成，形成双链的“桥”桥式 PCR扩增变性 变性双链的“桥”得到与 FlowCell相连的两条互补的单链 DNA分子第二轮桥式 PCR扩增完成桥式 PCR扩增完成 28循环的桥式 PCR线性化 双链“桥”变性为单链红色箭头为 P5接头上的切割位点线性化切割并冲走与 P5接头相连的那条 DNA链阻断阻断 3 OH进行 Read1 测序杂交 Index 测序引物，进行 Index
6、测序Paired End Turnround，合成 Read1互补链杂交 Read 2 测序引物，进行 Read 2 测序HiSeq SBS 测序流程HiSeq SBS 测序流程123Paired End Turnaround杂交 Read 1 引物Read1 测序引物将测序引物杂交到文库的接头上Sequencing By Synthesis， SBS测序原理4种 Fl-NTPs + 聚合酶拍照，收集信号 去阻断，切除荧光基团X 36 - 151可逆终止化学反应 一次加入 4种修饰的 dNTP(可逆终止子 ) 准确度高 可以得到同聚物序列 合成 照相，收集信号 去阻断，切除荧光基团下一个碱基合成100 MicronsClusters已完成测序合成的片段Blocked 3-ends变性掉已完成测序合成的片段恢复被阻断的 3 OHPaired End Turnround形成的 桥5-3延伸桥式 PCR5-3延伸Paired End Turnround形成的双链的桥Paired End Turnround模板链Paired End Turnround等温变性，完成 15轮桥式PCR后，进行线性化，将模板链切除，保留新合成的子链
