1、中国组织工程研究 第 20 卷 第 11 期 20160311 出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 11, 2016 Vol.20, No.11P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org1570www.CRTER.org李建国，男，1971 年生，河北省涉县人，汉族，2005 年河北医科大学毕业，主治医师，主要从事脊柱相关疾病与急救医学研究。通讯作者：胡成栋，博士，主任医师，硕士生导师，邯郸市中心医院骨二科，河北省邯郸市 056001 中图分类号:R318文献标识码:B文章
2、编号:2095-4344(2016)11-01570-07稿件接受：2015-12-28http:/WWW.crter.org五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析李建国 1，李 盼 2，3 ，4 ，尹合勇 3，5 ，刘 曦 2，周玉军 2，李海涛 2，李彦飞 2，王 飞 2，胡成栋 2(1邯郸市涉县医院急诊科，河北省邯郸市 056400；2邯郸市中心医院骨二科，河北省邯郸市 056001；3解放军总医院骨科研究所，北京市 100039；4河北医科大学，河北省石家庄市 050011；5南开大学医学院，天津市 300073)引用本文： 李建国，李盼，尹合勇，刘曦，周玉军，李海涛，李
3、彦飞，王飞，胡成栋 . 五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析 J.中国组织工程研究， 2016， 20(11):1570-1576.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.008 ORCID: 0000-0001-6164-7359(胡成栋)文章快速阅读：文题释义：玻璃化冻存方法：采用高浓度冻存溶液单步骤快速降温，溶液逐渐转变为玻璃样无定形体，组织在保存过程中细胞内外不形成冰晶，可避免细胞结构的破坏，有效保存细胞的活性。髓核：髓核为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间，是乳白色半透明胶状体，富于弹性，由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞
4、和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。摘要背景：冻存椎间盘可为同种异体椎间盘移植创造条件，传统的低温冷冻法常导致细胞内外冰晶形成从而造成细胞损伤，玻璃化冻存法可避免冻存过程中细胞内外形成冰晶而得到广泛应用，然而玻璃化法冻存椎间盘在内外文献中却少见报道，冻存试剂对髓核细胞的毒性研究也比较少见。目的：分析 5 种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对于兔髓核细胞的毒性作用，从而为玻璃化冻存椎间盘选择合适的冻存试剂。方法：选取目前最常用的 5 种玻璃化冻存试剂：二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇、丙二醇、丙三醇，采用单一 5 种、任意 2 种及任意 3 种玻璃化冻存试剂互相组合成各 10 种冻存试剂组合共 25
5、种。用CCK-8 和 FDA/PI 两种方法检测髓核细胞的细胞存活率。用统计学方法对所得数据进行统计分析，选出对髓核细胞毒性较小的玻璃化冻存试剂组合方案。结果与结论：两种检测方法检测结果：5 种玻璃化试剂对髓核细胞的毒性由小到大依次为：乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇。2 种冻存试剂组合和 3 种冻存试剂组合的毒性均比组成该组合溶液的任意一种单一玻璃化冻存试剂小。组合试剂中，含有乙二醇或丙三醇的 2 种冻存试剂组合或 3 种冻存试剂组合毒性均较小。故玻璃化冻存椎间盘可选用包含乙二醇和(或) 丙三醇的玻璃化组合试剂。关键词：组织构建；组织工程；玻璃化；毒性；冻存试剂；椎间盘；髓核细胞；
6、存活率主题词：椎间盘；存活率；药物毒性基金资助：邯郸市科学技术研究与发展计划项目 (0928108052)分析玻璃化冻存试剂单独或组合应用对兔髓核细胞的毒性作用主要观察指标实验旨在分析不同玻璃化冻存试剂单独或组合应用对于兔髓核细胞的毒性作用，从而为玻璃化冻存椎间盘选择合适的冻存试剂选取常用的玻璃化冻存试剂 单独或组合应用：采用单一、任意 2 种及任意3 种玻璃化冻存试剂互相组合成 25 种冻存试剂组合5 种二甲基亚砜甲酰胺乙二醇丙二醇丙三醇(1)5 种单一冻存试剂处理髓核细胞的 FDA/PI 染色结果分析(2)不同组合玻璃化冻存试剂处理髓核细胞后的 FDA/PI 染色细胞存活率分析(3)不同组
7、合玻璃化冻存试剂处理髓核细胞后的 CCK-8 细胞活性检测结果分析结果分析：李建国，等 . 五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1571www.CRTER.orgLi Jian-guo, Attending physician, Emergency Department, Shexian County Hospital, Handan 056400, Hebei Province, ChinaCorresponding author: Hu Cheng-dong, M.D., Chief phy
8、sician, Masters supervisor, Second Department of Orthopedics, Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei Province, ChinaFive kinds of vitrified cryoprotectants: toxicity of their alone or combination to nucleus pulposus cellsLi Jian-guo1, Li Pan2, 3, 4, Yin He-yong3, 5, Liu Xi2, Zhou Yu-jun2, Li
9、Hai-tao2, Li Yan-fei2, Wang Fei2, Hu Cheng-dong2 (1Emergency Department, Shexian County Hospital, Handan 056400, Hebei Province, China; 2Second Department of Orthopedics, Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei Province, China; 3Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 1
10、00039, China; 4Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China; 5School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300073, China)AbstractBACKGROUND: Transplantation of allogeneic intervertebral disc can be facilitated by the cryopreservation of the intervertebral disc. But the trad
11、itional cryopreservation methods always lead to the appearing of ice crystals inside and outside the cells which can cause cellular injury. The vitrification method that can avoid the formation of ice crystals have been widely applied in the cryopreservation field. However, only a few reports have a
12、ssessed the vitrified cryopreservation of the intervertebral disc, and the toxicity of cryoprotectants to the nucleus pulposus cells have not been fully explored.OBJECTIVE: To determine the order of toxicity of five commonly used cryoprotectants that are used alone or in combination to rabbit nucleu
13、s pulposus cells, and to select the optimal cryoprotectant for the vitrification of the intervertebral disc.METHODS: We chose five most commonly used cryoprotectants including dimethyl sulphoxide, formamide, ethylene glycol, propylene glycol and glycerol. Then, 5 single commonly used cryoprotectants
14、, 10 mixed agents containing any 2 commonly used cryoprotectants, and 10 mixed agents containing any 3 commonly used cryoprotectants were formulated. Cell viability of nucleus pulposus cells was determined using cell counting kit-8 and fluorescein diacetate/propidium iodide method. All data obtained
15、 were analyzed statistically to choose the appropriate combining scheme with less toxicity.RESULTS AND CONCLUSION: The order of the toxicity of these five commonly used cryoprotectants from low to high was ethylene glycol, glycerol, formamide, dimethyl sulphoxide, and propylene glycol. The toxicity
16、of the combined agents containing two or three commonly used cryoprotectants was lower than that of any commonly used cryoprotectants that were used to formulate them. The toxicity of the mixed agents that contained ethylene glycol or glycerol was lower than that of any other mixed agents. So we can
17、 choose the mixed cryoprotectants that contain ethylene glycol and (or) glycerol for the vitrification of the intervertebral disc.Subject headings: Intervertebral Disk; Survival Rate; Drug ToxicityFunding: Handan Science and Technology Research and Development Project, No. 0928108052Cite this articl
18、e: Li JG, Li P, Yin HY, Liu X, Zhou YJ, Li HT, Li YF, Wang F, Hu CD. Five kinds of vitrified cryoprotectants: toxicity of their alone or combination to nucleus pulposus cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(11):1570-1576.0 引言 Introduction目前 ， 在 器 官 移 植 、 人 工 授 精 、 病 毒 研 究 等 领 域中 ， 冻 存 细 胞
19、、 组 织 或 器 官 是 一 项 非 常 重 要 的 基 本 技术 1。 临 床 和 科 研 中 最 常 用 的 冻 存 方 法 有 慢 速 冷 冻 保存 法 和 玻 璃 化 冻 存 法 2， 玻 璃 化 冻 存 法 是 指 采 用 高 浓度 冻 存 液 单 步 骤 快 速 降 温 ， 使 冻 存 液 直 接 进 入 玻 璃 态 ，从 而 避 免 冻 存 过 程 中 产 生 冰 晶 损 伤 细 胞 。 而 慢 速 冷 冻法 采 用 分 步 降 温 ， 操 作 复 杂 ， 且 冻 存 过 程 中 产 生 冰 晶较 多 ， 容 易 损 伤 细 胞 。 玻 璃 化 冻 存 法 相 对 于 慢 速
20、冷 冻法是一个新颖、操作简单、成本低廉的方法 3。目前玻璃化冻存法已成功应用于冻存精子 4、卵母细胞 5、胚胎 6、软骨 7、心脏瓣膜 8、肾脏等多种细胞和组织 9，但 对 于 其 应 用 于 冻 存 椎 间 盘 ， 以 及 玻 璃 化 冻 存 试 剂 对于 髓 核 细 胞 的 毒 性 在 国 内 外 的 相 关 报 道 甚 少 ， 此 次 实验 的 目 的 是 检 测 目 前 最 常 用 的 5种 冻 存 试 剂 及 其 组 合试 剂 对 兔 髓 核 细 胞 的 毒 性 ， 从 而 为 玻 璃 化 冻 存 椎 间 盘选 择 最 佳 的 冻 存 试 剂 。1 材料和方法 Materials a
21、nd methods 1.1 设计 试剂配制，细胞实验，毒性检测。1.2 时间及地点 实验于2015年3月至9月在解放军总医院骨科研究所完成。1.3 材料1.3.1 实验动物 8周龄健康雄性新西兰大白兔 10只，由解放军总医院动物中心提供，动物质量合格证号：scxk(京)2010-0001。李建国，等 . 五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org1572www.CRTER.org1.3.2 主要试剂和仪器 1.4 实验方法 1.4.1 取材 给予新西兰大白兔肌注0.5%戊巴比妥钠(0.1 mg
22、/kg)处死，取材需在处死后 30 min内完成。后背部手术区域剃毛备皮，常规消毒、铺单，沿后背部正中切口纵行切开皮肤、深筋膜、肌肉，分离椎旁肌，用组织钳提起脊柱后分离椎体前肌肉，切断肋骨及部分横突，取下胸段及腰段脊柱，生理盐水冲洗3遍后迅速移至超净试验台。用尖刀划开胸1椎间盘前方纤维环，弯折相邻椎体显露间隙后可见椎间盘中胶冻状髓核附着于纤维环上，用眼科镊将髓核组织移至盛有DMEM-F-12培养皿中，其余节段髓核组织依次取出。1.4.2 细胞培养 用DMEM-F-12培养液将髓核组织涮洗2遍后用眼科镊移至盛有0.2%型胶原酶的安瓿瓶中，眼科剪剪碎髓核组织成1 mm 1 mm 1 mm的组织块，
23、放入无菌磁力转子在37 ，体积分数5%CO 2的培养箱中搅拌消化40 min。将消化成的混悬液移至离心管中，1 700 r/min离心5 min，弃上清液，加入0.25% 胰蛋白酶，将混悬液移至安瓿瓶中再次放入37 ，体积分数5%CO2的培养箱中搅拌消化20 min，加入适量含体积分数10%血清的DMEM-F-12培养液停止消化，离心弃上清液后接种于培养瓶中(培养液为含体积分数10%胎牛血清，100 U/mL青霉素， 100 mg/L链霉素的DMEM-F-12)， 3 d后第1 次换液，可观察到少量细胞贴壁，此后每天观察生长状态，每2 d换1次液，15 d后待细胞贴壁率约为80%时传代。选取第
24、2代生长状态良好的髓核细胞，用0.25% 胰蛋白酶消化后收集细胞，向96孔板实验组各孔中加入100 L细胞悬液(10 000细胞)，放入37 ，体积分数5%CO 2培养箱中孵育。1.4.3 玻璃化试剂的配制 选取目前最常用的5种冻存试剂：二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇、丙二醇、丙三醇，任意2种玻璃化冻存试剂组合成10组2-CPA，任意3种CPA组合成10组3-CPA(表1)。选择玻璃化冻存组织和细胞所需要的玻璃化冻存试剂浓度(约8 mol/L)，2-CPA中玻璃化冻存试剂浓度比例为11 ，3-CPA中玻璃化冻存试剂浓度比例为111 。1.4.4 玻璃化冻存试剂阶梯式加入及移出方法 96孔板中细胞贴
25、壁并培养48 h后对其进行换液，用移液管将各孔的培养液缓慢吸出后注入100 L DMEM-F-12。为防止加入过高浓度玻璃化冻存试剂对细胞渗透压产生较大影响，采取阶梯式加入方法。为缓慢达到8 mol/L的浓度，首先吸出50 L培养液，加入8 mol/L 的玻璃化冻存试剂50 L，得到4 mol/L的溶液。5 min后第2次吸出50 L液体，加入8 mol/L的玻璃化冻存试剂50 L，得到6 mol/L的溶液。5 min后第3次吸出50 L液体，加入10 mol/L的玻璃化冻存试剂50 L，最终得到浓度为 8 mol/L的溶液。之后，将96孔板放置于37 ，体积分数5% CO2的培养箱中 15
26、min。同样为防止移出玻璃化冻存试剂对细胞渗透压产生较大影响，采用阶梯式缓慢移出的方法。为缓慢移出8 mol/L玻璃化冻存试剂，首先移出50 L的液体，加入50 L DMEM-F-12，5 min后移出50 L液体后加入50 L DMEM-F-12，然后抽出全部液体后注入100 L DMEM-F-12，重复操作3遍，使培养液中残留尽可能少的玻璃化冻存试剂。1.4.5 FDA/PI染 色 细 胞 存 活 率 检 测 将 第 2代 髓 核 细表 1 玻璃化冻存试剂组合方案Table 1 The combination of the cryoprotectant agents表注：D：二甲基亚砜；G
27、：丙三醇；P：丙二醇；E：乙二醇；F ：甲酰胺。玻 璃 化 冻 存 试 剂 组 合 方 案单 一 冻 存 试 剂 D， G， P， E， F2 种 冻 存 试 剂组 合 (2-CPA)D+F， D+E， D+P， D+G， G+P， G+E， G+F，P+E， P+F， E+F3 种 冻 存 试 剂组 合 (3-CPA)D+F+E， D+F+P， D+F+G， D+E+P， D+E+G，D+P+G， G+P+E， G+P+F， G+E+F， P+E+F试剂及仪器 来源二 甲 基 亚 砜 (DMSO)、 甲 酰 胺(Formamide)、 乙 二 醇 (Ethylene Glycol)、 丙 二
28、 醇 (Propylene Glycol)、 丙 三 醇 (Glycerol)北 京 化 学 试 剂 有 限 公 司 ， 中 国磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS) Solarbio 公 司 ， 中 国100青 霉 素 /链 霉 素 双 抗 溶 液 Hyclone 公 司 ， 美 国DMEM/F-12 细 胞 培 养 基 康 宁 公 司 ， 美 国胎 牛 血 清 (FBS) 杭 州 四 季 青 生 物 工 程 有 限 公 司 ， 中 国FDA/PI Sigma 公 司 ， 美 国Cell Count Kit-8 试 剂 盒 同 仁 化 工 有 限 公 司 ， 日 本Image Pro Plus
29、图 像 分 析 软 件 Media Cybernetics 公 司 ， 美 国BX51 型 显 微 镜 Olympus 公 司 ， 日 本酶 标 仪 美 谷 分 子 仪 器 有 限 公 司 ， 美 国生 物 净 化 台 SW-CJ-1F 苏 州 净 化 设 备 有 限 公 司 ， 中 国colorsquid 磁 力 搅 拌 器 IKA 公 司 ， 德 国CO2 恒 温 培 养 箱 B5060 型 Hereus 公 司 ， 德 国李建国，等 . 五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH1573 1573
30、www.CRTER.org胞制成悬液，以110 8 L-1的细胞浓度接种于6孔板中的 盖 玻片上，37 ，体积分数5% CO2培养箱中孵育过夜，实验组各孔用阶梯式加入法缓慢加入相应的玻璃化冻存试剂使其浓度达到8 mol/L，对照组不加玻璃化冻存试剂，37 ，体积分数5% CO2条件下孵育1 h，将培养液吸出后向各孔中加入80 L的FDA(15 mg/L)浸染 5 min，PBS 漂洗 5 min后80 L的PI(15 mg/L)浸染 5 min， PBS漂洗5 min后将盖玻片取出放置于载玻片上后荧光显微镜观察并照相，用IMAGE PRO PLUS 6.0软件分析图片和细胞计数。细胞存活率(%
31、)=绿染细胞数/(绿染细胞数+红染细胞数)100%1.4.6 CCK-8细胞活性检测 实验组每组设10个重复孔，每板中设置对照组及空白对照组(加入100 L DMEM-F-12，无细胞)，边缘孔用 100 L无菌PBS填充。放置于37 ，体积分数5% CO2培养箱中孵育过夜。实验组及空白对照组各孔采用阶梯式缓慢加入的方法加入相应的玻璃化冻存试剂使其浓度缓慢达到8 mol/L， 置于37 ，体积分数5%CO 2孵育 15 min后，采用阶梯式移出方法逐步移出玻璃化冻存试剂，对照组不加玻璃化冻存试剂，各组再分别加入10 L CCK-8溶液，置于37 ，体积分数5%CO 2孵育 1 h。用分酶标仪测
32、定 450 nm各孔吸光度 A值，各重复孔A 值取平均数。细胞活性(%)=(实验组A值-空白对照A值/对照组A值-空白对照A值)100%1.5 主要 观察指标 FDA/PI染色结果。FDA/PI染色细胞存活率统计分析结果。CCK-8 细胞活性检测结果。1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料用Error! s表示，组间均数差异比较采用方差分析，两独立样本比较采用t 检验，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results2.1 FDA/PI染色结果 5种1-CPA处理过的髓核细胞，经FDA/PI染色，活细胞被 FDA染为绿色，细胞膜受损的细胞及死细胞被PI染为
33、红色，见图1。2.2 FDA/PI染色细胞存活率统计分析结果 1-CPA，2-CPA，3-CPA共25种冻存试剂处理过的髓核细胞经FDA/PI染色细胞存活率结果显示5种1-CPA处理过的髓核细胞存活率从大到小依次为乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇。20种2-CPA及3-CPA，包含有乙二醇(或)丙三醇的组合玻璃化冻存试剂图 1 五种单一冻存试剂处理的髓核细胞 FDA/PI 染色结果( 标尺=50 m)Figure 1 Fluorescein diacetate/propidium iodide staining of the nucleus pulposus cells after
34、treatment with five commonly used cryoprotectants alone (scale bars=50 m)图注：图 A-F 分别为乙二醇组、丙三醇组、甲酰胺组、二甲基亚砜组、丙二醇组、对照组中髓核细胞 FDA/PI 染色结果，绿色为 FDA所染，代表活细胞；红色为 PI 所染，代表细胞膜受损的细胞及死细胞。A B CD E F50 m 50 m 50 m50 m 50 m 50 m李建国，等 . 五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org1574www.C
35、RTER.org处理过的髓核细胞存活率较高，而包含甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇的2-CPA细胞存活率则相对较小，所以组合玻璃化冻存试剂中加入乙二醇和(或)丙三醇会减弱其对髓核细胞的毒性，而加入甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇则会增加其对髓核细胞的毒性，见图2。2.3 CCK-8细胞活性检测结果 CCK-8细胞活性和FDA/PI染色细胞存活率结果基本一致，经5种单一冻存试剂中处理过的髓核细胞中, 细胞活性从大到小依次为乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇。2种冻存试剂组和3种冻存试剂组中的细胞活性结果和FDA/PI染色细胞存活率结果略有偏差，见图3。3 讨论 Discussion椎间盘退行性变是一
36、种随年龄逐渐发展的过程，常可导致下腰痛和其他严重的脊柱疾病 10，是一个世界性的公众健康问题，并且导致了严重的社会经济负担 11。目 前 ， 治 疗 严 重 椎 间 盘 退 行 性 变 最 常 用 的 方 法 是椎 体 融 合 ， 但 是 ， 融 合 后 限 制 了 该 节 段 脊 柱 的 活 动 ， 使邻 近 节 段 脊 柱 的 运 动 和 压 力 增 加 ， 从 而 导 致 邻 近 节 段 退变 加 速 12。 人工椎间盘置换可维持脊柱稳定性，保留相应节段脊柱的运动，但是研究表明，人工椎间盘置换可以使脊柱运动方式发生永久改变，导致相邻节段椎体不稳以及压力增加，同样可加速邻近节段退变 13，
37、并且存在假体松动，下沉，磨损，自发融合等一系列问题 14。同种异体椎间盘移植是治疗严重椎间盘退行性变的一个理想方法，阮迪克等研究同种异体椎间盘移植系列动物实验及临床初步应用均取得了满意效果，并对多名同种异体椎间盘移植患者进行 5 年随访，随访结果也非常满意 15，但是由于同种异体椎间盘的供体少、尺寸匹配、保存时间、传染性疾病等原因限制了其在临床上的应用。所以，探索椎间盘的玻璃化长期保存方法，建立一个椎间盘组织库，将有助于同种异体椎间盘移植治疗的开展。现在无论是临床还是科研中保存椎间盘均采用慢速冷冻法，玻璃化冻存椎间盘少见报道。成功的玻璃化冻存方法取决于冻存过程中避免损伤细胞的冰晶形成，而避免冰
38、晶形成则取决于高速的降温速率和合适的玻璃化冻存试剂浓度，尽管高浓度的玻璃化冻存试剂可减少冰晶形成，但玻璃化冻存试剂浓度越高毒性越大，对细胞的损伤也越大 1。本实验的目的是检测各种单一和混合冻存试剂对髓核细胞的毒性，从而为玻璃化冻存椎间盘选择合适的冻存试剂。有效的玻璃化试剂的研究和发展需要对各种玻璃图 2 不同组合的玻璃化冻存试剂处理髓核细胞后 FDA/PI 染色细胞存活率统计分析结果Figure 2 Statistical analysis of cell survival rates from the fluorescein diacetate/propidium iodide staini
39、ng图注：D：二甲基亚砜；G：丙三醇；P：丙二醇；E ：乙二醇；F：甲酰胺。FDA/PI 染色结果中，单一冻存试剂， 2 种冻存试剂组合，3 种冻存试剂组合及对照组细胞存活率比较，20 种冻存试剂中包含有乙二醇(或)丙三醇的组合玻璃化冻存试剂处理过的髓核细胞存活率较高。图 3 不同组合的玻璃化冻存试剂处理髓核细胞后 CCK-8 细胞活性检测结果Figure 3 Statistical analysis of cell viability from the cell counting kit-8 test图注：D：二甲基亚砜；G：丙三醇；P：丙二醇；E ：乙二醇；F：甲酰胺。CCK-8 检测结果
40、中，单一冻存试剂，2 种冻存试剂组合，3 种冻存试剂组合及对照组髓核细胞活性比较，细胞活性从大到小依次为乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇。细胞存活力(%)细胞存活率(%)李建国，等 . 五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1575www.CRTER.org化试剂的毒性以及各种玻璃化试剂对于不同种类细胞的毒性充分掌握，目前虽然玻璃化试剂的毒性研究已经很多，但是其对髓核细胞毒性的相关文献却很少。此次实验中用直接和间接 2 种方法检测玻璃化试剂对髓核细胞的毒性，FDA/PI 染色方法是通过计
41、数细胞膜受损的细胞数目来直接评估髓核细胞活性，FDA可穿透细胞膜进入细胞内将活细胞染成绿色，死细胞由于细胞膜受损无法累积荧光素而无绿色荧光。PI 不能穿透正常细胞的细胞膜，但是可穿透受损细胞或死细胞的细胞膜从而与其 DNA 或 RNA 相互作用使得受损细胞显示红色荧光，因此，具有完整细胞膜的细胞呈现绿色，细胞膜损伤者则显示为红色。而 CCK-8 测定是通过检测吸光度来反映代谢活性从而间接评估细胞活性，适用直接和间接方法共同检测细胞活性可提高对细胞活性评估的准确率。此 次 实 验 中 对 5 种 最 常 用 的 玻 璃 化 冻 存 试 剂 及 其组 合 试 剂 对 髓 核 细 胞 的 毒 性 进
42、 行 了 排 序 ， 在 图 1 和 图2 中 可 见 两 种 检 测 方 法 得 出 了 的 结 果 基 本 一 致 ， 5 种单 一 玻 璃 化 冻 存 试 剂 中 ， 毒 性 最 小 的 为 乙 二 醇 ， 10组 2-CPAs 中 ， 毒 性 最 小 的 为 乙 二 醇 和 丙 三 醇 组 合 溶液 ； 10 组 3-CPAs 混 合 试 剂 中 ， 毒 性 最 小 的 同 样 为 包含 乙 二 醇 和 丙 三 醇 的 组 合 溶 液 。 此 结 果 和 研 究 玻 璃 化冻 存 试 剂 对 小 鼠 桑 椹 胚 16、猪软骨 17、虾胚胎毒性中乙二醇毒性最小的结果相一致，然而，研究冻存
43、试剂对鱼生殖细胞、鲍鱼胚胎 18、斑马鱼卵泡毒性中乙二醇和丙三醇毒性均较高 19，说明针对不同种属、不同细胞检测冻存试剂的毒性可能会有不同的结果 20。所以本实验的结果可能不适合其他种属组织或细胞的冻存，若需玻璃化冻存人椎间盘，则需重新检测玻璃化冻存试剂对人髓核细胞的毒性。而玻璃化冻存兔椎间盘时则可选择包含乙二醇和(或)丙三醇的冻存液。实验中玻璃化冻存试剂的浓度之所以用 8 mol/L，是因为玻璃化冻存椎间盘时必须达到 8 mol/L 这样的高浓度才能尽量减少细胞中冰晶的形成从而减小对细胞的损伤。从图 1 和图 2 可看出， 2-CPA 及 3-CPA 毒性均比组成该 组 合 溶 液 的 任
44、意 一 种 单 一 玻 璃 化 冻 存 试 剂小 ， 原 因 可 能 为 不 同 的 玻 璃 化 试 剂 混 合 时 可 能 会 发 生反 应 21。 另 外 ， 虽 然 二 甲 基 亚 砜 为 目 前 最 常 用 的 冻 存试 剂 ， 但 是 在 实 验 中 其 对 髓 核 毒 性 却 不 是 最 小 的 ， 所以 如 果 因 实 验 需 要 而 使 用 其 他 毒 性 较 大 的 玻 璃 化 冻 存试 剂 (如 二 甲 基 亚 砜 、 甲 酰 胺 、 丙 二 醇 )， 可 将 乙 二 醇(和 )或 丙 三 醇 与 其 混 合 以 减 小 其 对 髓 核 细 胞 的 毒 性 。另 外 ， 对
45、 照 组 两 种 方 法 检 测 得 出 的 细 胞 成 活 率 为 70%，说 明 含 有 除 玻 璃 化 冻 存 试 剂 毒 性 外 的 其 他 因 素 影 响 细胞 存 活 率 ， 可 能 的 影 响 因 素 有 ： 向 96 孔 板 和 6 孔板 接 种 前 需 用 胰 蛋 白 酶 消 化 贴 壁 细 胞 ， 消 化 过 程 导 致细 胞 损 伤 。 细 胞 培 养 过 程 中 细 胞 自 然 凋 亡 。 其 他未 知 因 素 。 冻 存 椎 间 盘时应尽量避免除玻璃化冻存试剂之外的其他因素损伤细胞。此 次 实 验 已 成 功 检 测 出 目 前 最 常 用 的 5 种 玻 璃 化冻
46、存 试 剂 及 其 20 种 混 合 玻 璃 化 冻 存 试 剂 的 毒 性 ， 然而 ， 对 于 选 择 合 适 的 玻 璃 化 冻 存 试 剂 ， 不 仅 要 求 玻 璃化 冻 存 试 剂 有 较 低 毒 性 ， 还 需 要 有 较 高 的 渗 透 性 22-24。假 如 选 择 了 毒 性 较 小 但 渗 透 性 较 差 的 玻 璃 化 冻 存 试 剂 ，其 进 入 椎 间 盘 组 织 和 细 胞 的 量 会 减 少 ， 组 织 和 细 胞 内玻 璃 化 冻 存 试 剂 浓 度 相 应 降 低 ， 从 而 达 不 到 玻 璃 化 冻存 所 需 要 的 高 浓 度 (约 8 mol/L)，
47、 导 致 冻 存 过 程 中 产 生过 多 损 伤 细 胞 的 冰 晶 ， 最 终 冻 存 失 败 。 所 以 ， 作 者 下一 步 的 工 作 是 检 测 这 5 种 单 一 玻 璃 化 冻 存 试 剂 和 20种 混 合 玻 璃 化 冻 存 试 剂 对 椎 间 盘 组 织 的 渗 透 性 ， 从 而为 玻 璃 化 冻 存 椎 间 盘 选 择 毒 性 小 、 渗 透 性 高 的 玻 璃 化冻 存 试 剂 。作者贡献 ：实验设计为胡成栋、李建国； 实验实施为所有作者；实验评估为李盼、尹合勇； 资料收集为刘曦、周玉军、李海涛、李彦 飞、王 飞。李建国成文，胡成栋审校。利益冲突 ：所有作者共同认可
48、文章有无相关利益冲突。伦理问题 ：没有与相关伦理道德冲突的内容。文章查重 ：文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测系统进行 3 次查 重。文章外审 ：本刊实行双盲外审制度，文章 经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明 ：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始 图片、数据 (包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和 销毁，可接受核查。文章版权 ：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Tsai HH, Tsai CH, Wu WT, et al.Numerical investig
49、ation into thermal effects of pre-cooling zone in vitrification- based cryopreservation process. Cryobiology. 2015; 70(1): 32-37.李建国，等 . 五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org1576www.CRTER.org2 Pyne DG, Liu J, Abdelgawad M, et al.Digital microfluidic processing of mammalian embryos for vitrification. PLoS One.2014;9(9): e108128.3 Jafarabadi M, Abdollahi M, Salehnia M. Assessment of vitrification outcome by xenotransplantat
