1、一. 原理 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 (BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一 BCA 法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到 25 微克/ 毫升，最小检测蛋白量达到 0.5 微克，待测样品体积为 1 20 微升。 二. 试剂盒组份 组 份 Cat: KGPBCA （250 assay 酶标板/50assay 1mL 比色杯） 蛋白标准溶液（0. 5 g/L ） 5 mL BCA 试剂 A 25 mL2 BCA 试剂 B 1mL 三. 操作步骤A 酶标板操作1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下
2、表加入试剂 孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液（L） 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（L） 20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量（g） 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0孔号 0 1 2 3 4 5 6 7蛋白质溶液（L）0 1 2 4 8 12 16 20去离子水（L）20 19 18 16 12 8 4 0相应蛋白质含量（g）0 0.5 1 2 4 6 8 102. 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1 ）配制适量 BCA 工作液，充分混匀；3. 各孔加入 200
3、L BCA 工作液；4. 把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37 放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量（g ）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；5. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为 20L，加入 BCA 工作液 200L，充分混匀，37放置 30 分钟后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值； 6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（g ） ，除以样品稀释液总体积（20L） ，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单 位：g/L） 。B 分光光度计测定 1. 标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂
4、孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 蛋白标准溶液（L） 0 5 10 20 40 60 80 100 去离子水（ L） 100 95 90 80 60 40 20 0 对应蛋白含量（g） 0 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 2. 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1 ）配制适量 BCA工作液，充分混匀； 3. 各管加入 1000L BCA 工作液；4. 各管充分混匀，37放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量（g）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线； 5. 稀释待测样品至合适浓度，
5、样品稀释液总体积为 100L，加入 BCA 工作液 1000L，充分混匀，37 放置 30 分钟后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值； 6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（g ） ，除以样品稀释液总体积（100L） ，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单 位：g/L ） 。四. 注意事项 1. 配制好的混合 BCA 工作液室温 24 小时内稳定。 2. 加入 BCA 工作液后，也可以在室温放置 2 小时，或 60放置 30 分钟。BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升 高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。 3. 待测样品浓度在 502000 微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。 4. BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的 SDS，5%的 Triton X-100，5%的 Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保 EDTA 低于 10mM，无 EGTA，二硫苏糖醇低于 1mM，-巯基乙醇低于 1mM.不适用 BCA 法时 建议使用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒。 5. 操作时要带手套。五、储存BCA 试剂 A 和 BCA 试剂 B 室温保存，蛋白标准液-20冻存。
