1、一心肌细胞的跨膜电位及其形成机制：（1） 静息电位：人及哺乳动物-90mv k+电流是构成静息电位的主要成分，方向是从膜内流向膜外。静息电位的构成：k +的平衡电位；（少量 Na+内流和生理性 Na+-K+泵活性）影响小（2） 动作电位：1. 去极化过程（0 期）：从-90mv+30mv。速度快，约 1-2ms。在外界适当刺激时由静息电位到达去极化。机制：有 Na+内流而导致，当刺激作用引起少量 Na+通道开放 到达阈电位（-70mv）引起 Na+通道的大量开放（正反馈） ，大量 Na+内流去极到 0mvNa +通道的关闭，可去极到+30mv 。Na+通道开放时间很短，约 1ms。由快 Na+
2、通道引起的快速去极化的细胞称快反应细胞，如心房肌，心室肌和浦肯野细胞，引起的动作电位称快反应动作电位。2复极化过程：时间 200-300ms，包括 1 期，2 期，3 期（1） 快速复极初期：+30mv0mv ，10ms ，快速复极初期，峰电位。主要原因：K +负载的 Ito（一过性外向电流） ，I to 通道在膜电位复极到 -40mv 时被激活，开放 5-10ms。1 期：快 Na+通道失活I to 被激活K +一过性外流快速复极化。（2） 2 期(平台期)：100-150ms,是心肌细胞动作电位特殊的主要原因。该期电流：外向电流（K +外流） ，内向电流（Ca 2+内流） ，总的结果是形成
3、一种随时间推移而逐渐增强的微弱的外向电流。a) K+外流：K +外流的通道有 IK 和 IK1 等多种。I K1 在静息电位时通透性很高。 0 期去极化过程中，I K1 通透性，这种 IK1 通道因膜的去极化而通透性的现象称内向整流。I K 在 2 期，K +外流的主要通道。b) Ca2+内流：L-型钙通道（慢通道，电压门控） ，去极化到-40mv 时被激活，这时Ca2+内流（去极化） 。K+外流（复极化） ，但随着时间推移 Ca2+通道逐渐失活。（3） 3 期（快速复极末期）：0mv-90mv,100-150ms,L-型 Ca2+通道失活关闭，外向电流 IK 进一步增加，I K1 也参与其中
4、，而膜电位越负，内向整流作用就越小，而形成了正反馈，直至复极化完成。3静息期：-90mv,-90 是由 Na+，Ca 2+的内流和 K+外流所致，所以要维持细胞要不听的排出 Na+，Ca 2+，摄入 K+。这一过程主要依赖 Na+-K+泵和 Na+- Ca2+交换体及 Ca2+泵。+30-9001 02 03 04 0Na+-K+泵 3Na +排出，2K +摄入，总的是外向电流。Na +- Ca2+交换体是继发性主动转运3Na +摄入，1 Ca 2+转出，产生内向电流。二 自律细胞的跨膜电位及其形成机制：区别在于 4 期自动去极化，原因是进行性净内向电流的产生。原因：（1）外向电流的减弱（2）
5、内向电流的增强（3）两者兼有。1，浦肯野细胞：形成机制包括两种：一种外向电流 IK 的及内向电流 If 的。起主要作用的是后者。If 在-60mv 左右的时候开始被激活，在-100mv 时完全被激活，然后开始自动去极化。在 -50mv 时 If 又被抑制，而在 3 期复极化末期再被激活。2，窦房结细胞（慢反应自律细胞）：特点（1）最大复极电位（-70mv）和阈电位（-40mv）绝对值均小于浦肯野细胞（2）0 期去极化幅值较小(70mv)，时程长，速度慢（ 3）没有明显的 1,2 期（4）4 期自动去极化速度快于皮肯也细胞。（1）去极化：-40mv 是激活 L-型钙通道，引起 Ca2+内流，因其
6、打开，关闭都很慢慢反应细胞。（2）复极化：0mv 时 L-型钙通道失活 Ca2+内流，I K 通道被激活开放，K +外流，达到最大负极电位。（3）4 期自动去极化：1 种外向电流的减弱和 2 种内向电流的增强。a) IK 在负极到最大负极电位时 IK 开始关闭，K +外流。 （I K 通道的时间依从性的关闭造成K+外流进行性减弱）b）If：因窦房结细胞最大负极电位是-70mv；If 激活缓慢，作用小。c）I Ca-T：在自动去极化到-50mv 时，通道被激活，引起少量的 Ca2+内流，可被 Ni2+阻断，一般 Ca2+通道阻断剂对 ICa-T 无作用。三 某种离子的“平衡电位”：以 K+为例说
7、明K+在细胞膜内外分布有差异，膜内远高于膜外，所以在膜两侧既有浓度差，也有电位差。所以这种离子向外流存在两种驱动力，其代数和称为“电化学驱动力” 。K +因浓度梯度驱动，由膜内向膜外转移。而扩散后产生的外正内负的跨膜电位差阻止其近一步外流，当电位差形成的驱动力，刚好对抗浓度差的驱动力时，此时的跨膜电位称“K +的平衡电位” 。四 静息电位的产生机制（RP）：1， 静息电位即各种离子（细胞膜对其通透的）平衡电位的代数和。2， 膜在静息条件下，主要对 K+通透，对 Na+也有一定的通透性，所以细胞膜的静息电位接近K +，但较其略小。3， 以下几点可影响膜的静息电位：（1） 膜内外 K+浓度差，膜外
8、 K+浓度高，静息电位减小。（2） 膜对 K+，Na +的相对通透性。（3） Na+-K+泵的活性水平。五 动作电位的产生机制（AP）：1， 电化学驱动力：某种离子的电化学驱动力等于静息膜电位与该离子平衡电位之差。内向电流：膜外膜内，Na +内流，Ca 2+内流（膜去极化）外向电流：膜内膜外，K +外流，Cl -外流（膜复极化或超极化）2， 动作电位期间膜电导的变化：对 Na+的电导增大，使 Na+在很强的电化学驱动力作用下，形成 Na+内向电流，使细胞膜迅速去极化，成为峰电位的升支；随后 Na+电导减小，形成峰电位的降支，同时 K+电导增加，K+外流增加，加速膜的复极。PS:1，测膜电导变化
9、的技术是 “电压钳” （V-clamp） 。2，离子流动的方向：膜对该离子的通透性；电化学驱动力的方向。六 心电图：P 波：心房去极化过程。QRS 波群：左右心室的去极化过程。T 波：心室的复极化过程。PR 间期：房室传导时间，窦房结产生兴奋，经由心房，房室交界和房室束到达心室，并引起心室肌产生兴奋所需的时间。PR 间期延长房室传导阻滞QT 间期：代表心室开始去极化到完全复极化所经历的时间。动作电位时程QT 间期愈短心率越快ST 段：复极化R-R 间期：心动循环七 离子通道的研究技术：欧姆定律（Ohms Law）：V=IR 此时，电流与电压的关系（ I-V）是一条通过原点的直线，其斜率即为该通
10、道的电导，而生物系统并非线性系统，只是应用欧姆定律进行近似的描述。膜电容（Cm ） ：其电容量等于单位电压（ E）下，从膜的一侧转移至另一侧的电荷量（ Q） ，即 Cm=Q/E，式中电容的单位为法拉（F） ，电压单位为伏特（V ） ，电荷单位为库仑（C ） 。如在膜两侧突然加以电压，则可产生电容电流 Ic，此电流立即达到峰值，然后以指数规律下降，即 Ic（Q ）=CmE=CmdE/dt 。膜电容的测量还可用于测量细胞膜表面积及推算单位面积上离子通道的密度等。（一） 电压钳技术的基本原理：电压钳技术是通过一个反馈电路使膜电位保持在指定的水平，当离子通道开放产生跨膜电流，导致膜电位改变时，可通过反
11、馈电路经微电极向胞内注入电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流，使膜通透性发生改变时膜电位保持不变，此时注入电流的变化就可反应膜电导或膜电流的改变。（二） 膜片钳技术的基本原理：膜片钳技术是用尖端直径 12m 的玻璃微电极吸管与经蛋白酶处理干净的细胞膜接触，通过 2030cm H2O 的负压吸引造成电极尖端与细胞膜形成高阻封接（10100G） ，使电极尖端下的小块膜片与膜的其它部分在电学上绝缘，并在此基础上固定膜片电位，监测几个 m 2 膜片上 13 个离子通道活动的方法。高阻封接的形成：高阻封接形成与否是记录细胞离子通道电流能否成功的前提，是进行膜片钳实验的关键一步。微电极尖端与细胞
12、膜形成封接的过程，可以采用软件或刺激器发出一个脉冲电压作用于微电极，造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流，再通过示波器或显示屏，观察电极电流幅度的变化来确定封接程度。在电极未入溶液之前，在显示器或示波器上可见一直线。当电极入液后，软件或刺激器发出的电脉冲经记录微电极、浴液及参考电极形成回路，1mV 的封接电压 流径 5M 的电极阻抗，则会产生 0.2nA 的电流浮动，随着微电极尖端接近、接触细胞膜，电极电阻则进一步增加，而电流幅度则随之减小，当在显示器或示波器上看到电流方波变为直线时，则形成低阻封接（50M） ，然后经微电极给予负压（-10-30cm H2O） ，即可形成高阻封接。再将电脉冲
13、调为 10mV，调节快、慢电容电流补偿，消除电容电流，就可进行细胞贴附式膜片钳实验，如果在此基础上再次给予负压或电脉冲，使微电极尖端下膜片破裂，则形成全细胞式。（三） 离子通道电流的记录:全细胞记录：在进行全细胞记录时，电极尖端与细胞膜接触并形成高阻封接后,施加负压吸引使电极尖端下膜片破裂，或施加幅度较大的电压（ZAP）击穿膜片，即可获得全细胞记录模式。 （1）通过电容补偿减小电容电流，然后调节膜片钳放大器记录模式为“VC” （电压钳） ，即可记录到在膜电位固定时的全细胞电流。 （2）若将膜片钳放大器记录模式转换为“CC”（电流钳） ，则可在电流钳状态下记录到细胞内电位 ；转换为“CC+COM
14、” 模式，则可进行电刺激以诱发和记录动作电位。进行高阻封接时，需注意的是：在微电极未入液之前常施以正压，使电极内有液体从电极尖端流出，防止浴液表面灰尘或溶液中粒子附着于电极尖端，影响高阻封接。如果微电极尖端与细胞膜接触后，仍不能形成高阻封接，则电极即不能再用，需重新换一根微电极继续封接。电极尖端与细胞膜接触，稍加负压后电流波形变得平坦，此时，如使电极超极化，则有助于加速形成高阻封接。电极入液后封接的成功率与入浴液后的时间呈反比，电极内液中的肽类或蛋白质成分也会有碍于封接形成。(入浴时间愈短，封接愈快) 电流钳（Current-clamp）：记录电压（动作电位-action potential）
15、 ；电压钳（Voltage-clamp）：记录离子通道电流（Na +, K+, Ca2+, Cl-） 。1，L-型钙通道：激活的膜电位较高，一般-60-10 mV。为避免由钠电流产生的干扰，常将膜电位钳制在-50 mV 以下，这样即较大程度的激活了 L-型钙通道，又有效的抑制了钠通道的活性，又由于 L-型钙通道的激活与失活时间较长，往往需几十甚至数百毫秒，因此去极化脉冲的保持时间在 200500 ms 之间，L- 型钙通道的 最大电流约在 0+10 mV，反转电位为+40+50 mV 左右。L-型钙通道除对二氢吡啶、Verapamil 以及硫氮卓酮等钙拮抗剂敏感外，对某些无机离子如Cd2+也很
16、敏感。 20M Cd2+就可使钙通道活性抑制 90%以上。因此常被用作全细胞膜片钳实验中的工具药。 注意：L-型钙通道电流测定时,可随时间产生衰减,即所谓 Rundown 现象。尽管许多学者进行了大量的研究，但仍不能有效地防止这一现象，严重时在 10min 之内就可使钙电流减少3050%。如不加以矫正，则直接影响结果的可靠性，尤其是给药前后的对比，因此在实验设计中，必须考虑到这一因素，并设立严格的对照组。2，内向整流钾电流（I K1）：即背景钾电流，主要参与心房肌，心室肌静息电位的形成，并直接影响动作电位的形态，在平台期，通道开放很小，而在复极化时活性增加，从而产生动作电位的快速终末复极化。由
17、于这种通道亚型的内向整流特性，当膜电位去极化时，稳态电流呈一定的外向电流，而当钳制电位负于膜电位时，则呈明显的内向电流，其强度是电压依赖的。通常膜电位从超极化（如-120mV ）至去极化（如+30mV） ，将各钳制电压末期的电流对膜电位作图，得出电流一电压关系曲线（IV 曲线） ，其形状为“N”型，其反转电位即零电流电位主要受细胞外钾的影响，即当细胞外钾浓度增加时，反转电位向正的方向移动。3，延迟整流钾通道电流（I K）：在去极化过程中被缓慢激活的一种外向电流，在短时间内不能达到稳态，因此测定这类钾通道时，去极化时间应保持足够长，有时需数秒。在某些组织如心肌全细胞记录中，当去极化完成，恢复至钳
18、制电位（-50mV 以上）时，会出现一外向尾电流，它也可代表延迟整流钾电流。现已用于延迟整流钾通道选择性阻断剂的研制。它的变化也是电压依赖性的，单个心室肌细胞可达 100200pA。已知 IK 含有两个电流成分，即快速激活电流成分 Ikr 和慢激活成分 IKS，现有的类抗心律失常药均选择性作用于 Ikr，筛选有关抑制 IK，甚至选择性抑制 IKS 的类抗心律失常药物具有重要的理论和实际意义。4，瞬时外向钾通道（I A 或 Ito）：电压门控的钾通道，它存在于多种组织中，也是人心室肌中主要的钾通道亚型。其电流特征是在去极化早期出现，是激活与失活均较快的一种外向电流。由于 Ito 的存在，使动作电
19、位早期快速复极化。I to 常与 Ica 相互影响，因此只有在阻断 Ica 时才能准确测定 Ito，常用 CdC12 或钙拮抗剂硝苯吡啶和 Verapamil 等阻断钙通道,但近来发现当硝苯吡啶剂量稍大时也有阻断 Ito 作用。把钳制电位保持在 -40-60mV 逐渐去极至+60mV 可见去极化程度与电流强弱呈正相关。钾通道阻断剂 4-氨基吡啶（4-Ap ）可以选择性抑制这一外向电流。注意：在测定钾通道电流时，也可能会出现 Rundown 现象。I K、I to 及 Ik tail 等均可出现衰减，一般在 10min 之内电流衰减可达 1030%，因此在研究药物作用及观察时间较长时，都应设立对照组。
