1、第二章 石蜡切片技术,一、显微切片技术产生的原因,光学显微镜发展到一定程度之后，渴望知道细胞结构 由于组织太厚，光线很难穿过 压片可使组织变薄，但引起变形、易位，除核外，看不到其他结构，因此需要切片变薄。 因细胞水多，太软，无法切片鉴于上述情况找到一种方法使细胞水被替代，变硬，能直接切片的方法，最广泛使用的就是石蜡切片技术,二、石蜡切片技术的优点,为什么选择这一技术呢？主要因为它有以下优点：便于推广、经济、适用、简便。 经济,价格低，可反复使用； 技术难度不大，容易掌握，但要精通也不容易； 设备要求不高 ； 可长期保存； 染色容易，而且都能被染色，形成好的反差和好的选择性。,三、石蜡切片的主要
2、过程,杀生（取材）固定冲洗脱水保存透明石蜡透入包埋切片复水染色脱水封藏观察保存 （一）取材、固定、洗涤、脱水 （二）透明、透蜡、包埋 （三）切片、贴片 （四）染色、封藏,杀生（动物） 1.目的：动物必须杀生，然后取出所需组织 2.方法：一般采用乙醚（氯仿）麻醉后解剖，取出所需组织。 3.注意事项： 性别合适 麻醉前动物生活正常，以免影响其代谢活动，进而影响细胞结构 取材部位要准， 速度快,（一）取材,1.目的：得到所需要的组织2.方法：a.用剪刀剪下组织b.冲洗动物组织，动物（生理盐水、糜蛋白酶溶液）植物（缓冲液或水）冲洗干净，防止失水，避免压挤损伤，用生理盐水、糜蛋白酶冲去表面的血、粘液和赃
3、物。c.切成小块3注意事项： 要准 要快 避免损伤（方向，刀要快，不能挤压） 植物取材：用剪刀剪下材料时一定要植物生活正常，不要因缺水、营养和温度光照发生明显改变，影响细胞结构，同时发育程度、部位要准。,（二）固定,1.目的：为了使取样的细胞在形态结构和成分方面保持与生活的状态一样，就必须迅速杀死细胞避免失水变形，自溶破坏结构等。固定液的选择：快；不溶解；不收缩膨胀；软硬适中；增加折光度；增加染色能力；长期保存等7项。,2.方法,（1）固定剂的种类：一般采用化学固定单纯固定：只用一种试剂固定：混合固定：用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如：,单纯固定：,福尔马林formalin:10%的
4、甲醛（37%40%） 醋酸（0.3%5%） 苦味酸（饱和溶液，三硝基苯酚） 铬酸0.51% 锇酸12% 升汞（氯化汞饱和水溶液约7%）,混合固定：,用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如： 卡诺氏固定液酒精：冰醋酸（3：1）酒精：冰醋酸：氯仿（6：1：3）适用于动植物一般组织细胞。 FAA福尔马林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精90 ml 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,可防止材料收缩;还可加入5 ml甘油(丙三醇)以防蒸发和材料变硬. 但单细胞及丝状藻类除外，也不适于细胞学研究,卡诺氏固定液(Carnoys Fluid) 适用于一般植物组织和细胞的固定,常用于根尖,
5、花药压片及子房石蜡切片等.有极快的渗透力,根尖材料固定1520min即可,花药则需1h左右,此液固定最多不超过24h,固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止;如果材料不马上用,需转入70%酒精中保存.固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。,F.A.A固定液 又称标准固定液,万能固定液.适用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片.在植物形态解剖研究上应用极广; FAA固定液的优点在于：兼有保存剂作用,冰醋酸既能抵消酒精和甲醛对组织的收缩作用又是细胞核的优良固定剂，沉淀核蛋白，且对免疫组化无碍更无掉片之理。FAA固定液具有强
6、大的固定效能，较之单纯固定更科学更快更好！ 对染色体的观察效果较差.,（2）固定方法,静置固定：将组织块放入盛有固定液的小的称量瓶、小烧杯或青霉素瓶中，在室温或低温（04）固定一段时间，不断摇动能增加固定效果，植物和动物经常使用这种方法。 灌注固定：常用于动物，将固定液通过已麻醉的动物血管中，让血液流动，固定所需细胞，该方法有点，固定均匀，不出现自溶现象，但较繁琐。,3.固定时应注意的事项,固定条件的选择：种类、浓度、温度和时间固定要快否则会自溶：组织快，不能太多，否则固定不透：,（三）冲洗,1.冲洗的目的除去固定剂，主要是防止固定的毒害作用，固定时间太长，组织收缩变脆。,2.冲洗的方法, 冲
7、洗液随固定液而定，冲洗的选择：不形变提取，不反应，有效除去固定液。 固定液为水溶液时，以水或低浓度的酒精冲洗； 固定液是酒精多以不同浓度的酒精冲洗，以酒精冲洗，浓度要低于固定液的酒精浓度。材料与酒精的比例一般为1：10（加入的体积） （70%乙醇换洗3次，每次2060min ）,（2）冲洗方法,静置冲洗：加入冲洗液，静置一段时间，倒出该液，加入新的冲洗液，反复几次（56次），每次30分钟左右，振荡有好处。（时间开始一次为2030分钟，以后几次可延长12h，）具体时间与材料性质、大小和温度有关。 流水冲洗：将小瓶用纱布蒙住，放入盆中，流水冲洗，效果较静置冲洗为好，时间为1224h，但流水不能太大
8、太急，也不能太长，太长使组织变软肿胀，冲洗时间有时长达24h左右，如木本植物的木质部。,3.注意事项,(1) 冲洗彻底否则收缩、变硬、抽取(2)不能时间太长太急变软，肿胀（吸水）(3) 摇动有利于冲洗干净加快分子运动,（四）脱水,1. 目的：因石蜡与水不混合，在用石蜡透入前必须将细胞中的水彻底脱掉，否则石蜡进不去材料，无法让细胞变硬，无法进行切片。,2.方法,脱水剂的选择原则：凡与水和石蜡亲和性好的且不使细胞剧烈收缩膨胀，不能大量抽提细胞成分均可作为脱水剂。常用的是乙醇和丙酮，使用乙醇最多，此外还有叔丁醇、正丁醇等。 脱水的一般过程：多采用静止脱水15%35%50%70%83%95%100%（
9、23次），丙酮较酒精快，浓度相应低一些。起始浓度的选择主要根据材料的性质而定，动物和幼嫩植物一半从15%或35%开始；老的或木质成分多从15%或70%开始。如木本植物的茎。 脱水时间：每次脱水时间也是根据细胞的老嫩即含水量和组织块大小及温度而定，原则是嫩短老长，嫩的15-30m，老的30m-4h，还可长达8-12h，如洋葱一般为1h 脱水的温度：室温和0-4C两种，前者时间短，后者缓慢一些。,3.注意事项：,脱水一定要脱干净，彻底，否则石蜡很难进入而导致不能切片。 脱水时间长短要合适，太短脱不干净，太长低浓度容易细胞变软，膨胀；太长高浓度则细胞收缩，变脆，提取严重，影响切片。 梯度不能太大，负
10、责拉伤，最后100%乙醇脱水要2-3次，以保证脱水完全。 保存，只能在70%酒精中保存（04）若时间不够可暂时保存在70%酒精中过夜，第二天再继续实验。也可长期保存几个月，在1：1：1=甘油：蒸馏水：95%酒精中保存最好（低温）,（五）透明,1.目的：为了使石蜡更好进入组织，解决乙醇与石蜡亲和性较差的问题，并能增加遮光系数，且与封藏剂很好混合；,2.方法：,（1）透明剂的种类a.选择的原则：与乙醇和石蜡均有较好的亲和性，又不破坏细胞结构（形态、结构）不能大量提取细胞成分b.种类：二甲苯、氯仿、香柏油，苯胺油，其中以二甲苯最好 （2）透明过程（乙醇：二甲苯）2:11:11:2纯（二甲苯）但有时也
11、只用1：1和纯的二甲苯即可，时间要长（1h）纯的二甲苯要多换几次保证去乙醇完全。 （3）时间：随组织块大而异，也与温度有关。一般为30m2h，如洋葱根尖为每次1h （4）温度：多常温。,3.注意事项,（1）透明要完全彻底除去乙醇或丙酮 （2）时间过长会使组织变硬变脆，出现收缩，过短，透明不彻底，乙醇除不尽，石蜡进入不好，会出现空洞。 （3）换二甲苯是要快，因二甲苯易挥发使浓度改变 （4）盖严防止水分和空气（CO2）进入，出现混浊和酸度变化因而受酸影响。,（六）石蜡透入,1.目的：让石蜡透入细胞，代替二甲苯支持细胞，增加强度，防止在切片时细胞变形和破碎，便于切片。,2.透蜡,（1）对石蜡的要求（
12、2）透蜡的过程,（1）对石蜡的要求,熔点已知 质量：结构细腻， 光滑均匀 无灰尘和挥发物；a透明：b无不透明的物；c 无气泡 种类：石蜡熔点在4260之间，包埋石蜡在5060之间，可分为两种软石蜡5256（动物）硬石蜡5458（植物）浸片（4um以下）用5660为好。,石蜡好坏可用以下方法辨别：a.熔入纸盒中无气泡（挥发物；）b.无不透明颗粒（灰尘），断裂处无颗粒（灰尘，切片无细小颗粒（灰尘）C.在30-35放置24小时无气泡或不透明结晶状小点。 不好石蜡的利用：加热至开始冒烟后移至火焰较小的的灯上，再加热数小时，除去挥发物和水分；冷却后杂质下沉可除去，所以使用过的石蜡可再重复利用切效果较好。
13、,透蜡的过程,植物：二甲苯:石蜡纯石蜡 50ml烧杯2个 1/2二甲苯1/2石蜡石蜡石蜡，根据组织块的大小，每步20min60min，温度62 换蜡的方法：A：移材料：B:倒石蜡 动植物材料在透蜡的过程中前者时间短后者时间长，透蜡时以换蜡不转移材料为好。 动物：从透明剂中取出透明剂石蜡混合液（1520min）纯石蜡换一次新鲜石蜡。（透蜡时间为11.5h）洋葱根尖为1h。,3.注意事项：,（1）透蜡要完全不能残留二甲苯； （2）温度恒定，以较低温度为好，较高温度提取严重，因为二甲苯和石蜡都是脂类物质容物； （3）时间合适，较短为好，否则会变硬变脆出现收缩。,（七）包埋,1.目的：以石蜡代替细胞中
14、水分变硬，形成含有材料的石蜡块，体积增大，便于切片也便于保存；2.方法：（1）石蜡选择同包埋，让透蜡后的组织块包埋在石蜡中，形成一定的形状。（2）准备：折纸盒，准备温台（或电热板）和酒精等及新鲜石蜡，解剖针、标签和一盆冷水（3）倒蜡（4） 冷却,操作：,纸盒标签加组织倒石蜡拨正组织块放入水盆沉底 盆中放满冷水，点燃温台下的酒精灯或（电热板），放3个解剖针和纸盒在温台上. 将标签放入盒底，文字朝下 将温箱中取出的石蜡杯，将材料拨入纸盒内，再倒入新鲜的石蜡，将材料拨到适当位置。 将纸盒轻轻提取放入盆面，表面凝固后倾斜使冷水进入盒中，立即沉入水中迅速冷却，30min1h可取出，取出蜡条备用。,3.注
15、意问题：,（1）包埋时石蜡不能过早冷却（放在温台上） （2）冷却要快 （3）若出现白色、浑浊结晶，可能是由于：a.脱水不干净；b.组织内部或石蜡中混有透明剂；c.组织块倒入时，周围蜡已凝固：d.石蜡冷却太慢；e.石蜡质量不好。,（八）切片,1. 目的：将观察的材料变薄，光线容易穿过； 2方法：（1）固定：取出蜡块，修整材料长条形，避免损伤。然后将底部粘于金属和渗蜡木块上。（2）修块：修块使切片成蜡带而不弯曲，组织便于镜检，组织块需要修整齐，最好为梯形、长方形、正方形。组织块必须上下平行，但左右的蜡、上下的蜡不要太多或太少；正方形或长方形，可各切去一角，以便识别。,切片：,切片机结构：A：微动装
16、置（调节切片厚薄）B：夹刀部分；C：夹物部分。两类：滑行切片机：划刀部分是滑动的；夹物部分是固定不变的，但可升降；旋转式切片机：则是夹物部分上下向前移动，而夹刀部分固定不动，最薄切2um，最厚40um。,切片刀：双平面刀（两面平，两种机型均可）平凹刀（一面平，一面内凹）双凹刀（两面都凹）保安刀片玻璃刀,切片方法将切片材料的木块夹在刀夹上，厚度一般612um，连续转4050次，用毛笔挑起蜡带，平放在蜡光纸上，靠刀的一面较光滑，应向下。镜检组织细胞是否完整，有无空洞，皱褶，碎裂等。,贴片,将烫板加热到35度左右； 载玻片涂上蛋白甘油，用手涂抹（蛋清：甘油1：1，加1%的麝香草；滴加蒸馏水数滴，放上
17、蜡带切断，应短于载玻片的1/5或2/5）将载玻片移置烫板上，使片展平； 除去多余水分再放至烫板（35度）23h后即可。,3.切片中经常出现的问题及其原因,隔片（太软，刀太钝） 刀痕（刀有缺口，石蜡中有硬的颗粒） 脱片（不干净；粘片剂变质；切片光面未向下；切片太小而厚；组织过硬；切片未充分展开；切片贴片面未充分干燥（组织部分呈白色）。 弯曲（不平行） 不成带（石蜡太少：温度低） 卷筒（温度过低，过硬，太钝） 粘刀：（温度太高，过软，太钝） 纵裂：（缺口；颗粒，太硬） 厚薄不均：夹的太松，刀的倾角太大，太硬）,（九）染色,1. 目的：增大反差，增大选择性 2. 原理：有两种学说物理作用：化学学说：
18、它认为染色深浅完全取决于化学作用所致如细胞质呈碱性，细胞核呈酸性，红血球呈中性，因而分别被酸、碱和中性染料亲和而起反应。 物理学说和化学学说都较片面，不能全面深入解释许多现象，如孚尔根反应，既有无色品红与染色质之间的化学反应，有选择性，但长时期浸入水或酒精中也会部分或全部退色（综合学说）,3.染色剂的种类：天然：地衣红（cicein、苏木精chematoxylin、洋红carmine（胭脂尘）是从雌性胭脂虫粉末中提出人工：苯胺（从苯胺制成的苯胺染料aniline dyes）碱性：番红、结晶紫（核）；酸性：固绿、署红（质）；中性染色的如赖特（wright）和吉姆萨Giemsa（血球）血液染剂,植
19、物组织切片经番红、固绿双重染色,1 脱蜡 二甲苯(2)二甲苯(1)，每步510min； 2 复水 1/2乙醇+1/2二甲苯100%乙醇(2) 100%乙醇(1) 85%乙醇 70%乙醇 50%乙醇 30%乙醇蒸馏水,每步2min； 3 初染 植物切片浸入苯胺番红染液中12h，尽量使红色浸透，否则容易褪色。（也可在石蜡包埋前用番红进行整体染色。 4.浸洗 蒸馏水浸洗35min，洗净切片上的余色。 5.复染 固绿染色液1020s。复染的时间不能太长，使细胞核和木质化的部分呈红色，细胞质及纤维素的部分呈绿色为最佳。 6 浸洗与分色 用无水酒精清洗掉余色同时也可分色，浸洗数秒即以免固绿褪色。 7.透明 1/6石碳酸+5/6二甲苯5min（2）二甲苯（3） 8封片（同上）,动物组织HE染色,苏木精 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，简称HE染色法 ，石蜡切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染液为碱性 ，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料 ，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。,
