1、第四章 发酵工艺过程控制,第九节 杂菌与噬菌体的防治, 纯种发酵（单菌或混菌）；菌种以外的微生物都被视为杂菌。 所谓染菌，是指在发酵培养基中侵入了有碍生产的其它微生物。 几乎所有的发酵工业都有可能遭遇杂菌或噬菌体的污染。染菌的结果，轻者影响产量或质量，重者可能导致倒罐，甚至停产，造成原料、人力和设备动力的浪费。,防止杂菌和噬菌体污染是保证发酵正常进行的关键之一,一、杂菌污染的原因与防治,1、 从染菌的现象分析染菌的原因,1）从染菌的时间分析, 早期（如接种后12 h或24 h），除了种子带菌外，主要是培养基或设备灭菌不彻底。 相反，中、后期染菌则可能与中间补料、设备渗漏以及操作不合理等有关，也
2、可能是空气过滤器不严所致。,2）从污染的杂菌类型分析, 污染耐热的芽孢杆菌，多数是因培养基灭菌不彻底或设备存在死角所致； 污染无芽孢杆菌、球菌等不耐热菌，可能是从蒸汽的冷凝水中带来的，或空气系统不严造成。,3）从发酵罐及批次分析,大批发酵罐染菌是指整个工厂各个产品的发酵罐都出现杂菌现象，而且染的是同一种菌，主要是空气过滤器除菌不净，空气带菌而造成的。,个别发酵罐连续染菌，较多地是由于设备问题而造成的。如阀门的渗漏或罐体破损，特别是蛇形管的穿孔，有时不易察觉。有时设备破损引起的染菌会出现每批染菌时间前移现象。,个别发酵罐偶然染菌的原因最为复杂，各种染菌途径都有可能引起。,根据谷氨酸发酵情况分析，
3、染菌原因以设备问题（设备渗漏、管道不严、设备死角）和空气问题（过滤器不严、过滤器失效、过滤器受潮）为主，种子（二级种子染菌）次之，而培养基消毒不透的情况较少。,2、 防止染菌要点,（1）空气系统,提高空压机进口空气的洁净度、防止空气带油、水及过滤器失效。 如提高空压机吸气口位置并加强压缩前的过滤；防止空气冷却器漏水而进入空气系统；在空气过滤器灭菌时要防止冲翻介质而短路，防止烤焦介质或着火；装填纤维介质时要压紧；操作中要防止空气的压力剧变和流速激增等。,（2）设备, 发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角”。与物料、空气、下水道连接的阀门皆需保证严密度。 用超净工作台及净化室代替
4、无菌室，以提高无菌程度。 连消设备的连消塔要简单，易拆装清理，操作时蒸汽能与物料均匀混合，并易控温度；维持罐在料液输送时培养基在罐中能均匀地缓慢上升，不走短路。,（3）工艺操作, 空罐准备 放罐后应进行全面检查和清洗。要清理罐内残渣，去除罐壁污垢，清除空气分布管、温度计套管等处堆积的污垢及罐内的“死角”。要防止端面轴封漏气、搅拌添料箱及阀门渗漏等。蛇管和夹层要按设计规定的压力定期试压。空消时应先将罐内空气排尽，保持蒸汽畅通，阀门、管道均要彻底灭菌。, 实罐灭菌 配制培养基时要防止原料结块。配料罐出口应有筛板过滤器（筛孔直径0.5mm），以防块状物及异物进入罐内。灭菌时，要保证各路进气畅通及罐内
5、料液翻腾激烈，控制好温度与压力，严防泡沫冒顶及料液倒流到空气系统中。, 连消 料液进入连消塔前需先预热。灭菌过程中，料液温度及其在维持罐停留的时间都必须符合要求，确保灭菌彻底。当冷却管开放冷水时，防止因突然冷却造成负压而吸入外界空气。为确保灭菌温度稳定，连消必须实现自动控制。, 补料 补入发酵罐内的料液一定要保证无菌。, 种子 有关种子操作的制度要严格遵守；摇瓶瓶塞要确保严密。, 无菌试验 无菌试验要严格取样操作，力求减少误差。应同时用肉汤和双碟作对照，以便迅速作出判断。当发现染菌时，要通过分辨菌型来探索菌源，并对杂菌做耐热试验考察。如果怀疑种子罐染菌，则种子不能轻率进发酵罐。,3、 无菌检查
6、与染菌的处理,为了防止在种子培养或发酵过程中污染杂菌，在接种前后、种子培养及发酵过程中分别进行无菌检查，以便及时发现染菌，并在染菌后及时进行必要处理是很重要的。,（1）无菌检查, 染菌通常通过3个途径发现：无菌试验、发酵液直接镜检、发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要依据。 无菌试验方法有双碟培养、斜面培养、肉汤培养等，其中以双碟和肉汤培养为主。,（2）染菌的判断, 以肉汤和双碟培养的反应为主，镜检为辅。 每8h一次的无菌检查，至少用2只酚红肉汤及1只双碟同时取样。 无菌试验时，如果肉汤连续3次变色（红黄）或产生浑浊，或双碟培养连续3次有杂菌菌落，即判断为染菌。,（3）染菌率的统计,
7、以发酵罐染菌批（次）为基准，染菌罐批（次）应包括染菌重消的重复染菌批（次）在内。整个发酵周期中，无论前期或后期染菌，均作“染菌”论处。,（4）染菌的处理,发现染菌后，应立即根据染菌的种类及产生菌的菌龄等具体情况分别进行处理。除据染菌时间及危害程度对污染罐进行挽救或处理外，对有关设备也应进行处理。, 发酵中后期染菌或前期染菌轻微而发现较晚时，可加入适当的杀菌剂或抗生素；或把高单位的后期发酵液压一部分到染菌罐中，抑制杂菌生长速度；或者降低罐温，减缓杂菌繁殖速度。, 种子罐染菌后，种子不能再接入发酵罐中，这时可用备用种子接种。如无备用种子，则可选一适当培养龄的发酵罐培养物作种子，即生产上所说的“倒种
8、”。, 发酵罐前期染菌后，如培养基中C、N含量尚高，则可重新灭菌，接种后再运转；若染的杂菌危害性较大，则放掉部分料液，补入新料液，重新灭菌、接种。,二、噬菌体污染的防治,在国内外，发酵工业中噬菌体的危害是一个普遍的问题。对于丙酮丁醇、氨基酸、酶制剂和抗生素等发酵都有噬菌体的危害，所带来的经济损失是相当惊人的。,1、噬菌体的污染源, 噬菌体广泛地存在于适合宿主生存的泥土、污水和空气中； 发酵工业生产菌的噬菌体可以从异常发酵液和工厂环境中分离出来，溶源性细菌也混杂在工厂周围环境的细菌中； 一个新的发酵工厂往往在投产不久便会出现噬菌体污染； 研究认为，当有许多细菌存在时，相应的噬菌体就会马上出现，其
9、浓度在自然条件下很容易增高。, 工厂本身的排放物有时也给重复污染提供了噬菌体来源。生产过程中发酵气体排出，可以带有大量的生产菌。 在生产罐污染有少量噬菌体（尚可进行生产）时，噬菌体也被排到环境中，造成恶性循环。 废弃的发酵液处理不当可以成为难以对付的污染源。,2、 噬菌体污染与发酵异常,噬菌体污染后的情况因发酵工业的种类、污染的噬菌体特性、污染时间、感染复度（即培养物内的噬菌体与细菌的比率）、培养基成分、发酵罐内的物理和化学条件不同而异。即使同样的噬菌体并不一定引起同样的异常发酵情况。,一般来说，噬菌体污染引起的异常发酵有以下表现：（1）污染较轻，或在发酵末期污染，则使发酵过程减慢或降低发酵产
10、率。也有的行业在这种情况下产率反而增高； （2）在细菌对数生长期污染，而且污染量大，就会造成细菌溶解，发酵终止。 噬菌体污染后可以观察到糖消耗减慢，pH异常变化，产气减少，发酵稀薄，继之活的生产菌减少。通过测定可过滤性、传染性、宿主特异性、溶菌斑形成能力和电镜观察来鉴别异常发酵中的噬菌体。,3、噬菌体污染的防治,发酵工业生产中噬菌体污染是一个复杂的问题，虽然至今还没有完全满意地解决这一问题，但采取一些措施来防治噬菌体的污染，也有一定的成效。,（1）防止噬菌体入侵和蔓延,发酵工厂生产菌的噬菌体广泛存在于其周围环境中，为了防止噬菌体的污染，保持周围环境的清洁是必要的，所有设备和设施如发酵罐、管道系
11、统等要进行灭菌处理。 妥善地保藏菌种、对原料和水进行无菌处理、对工厂空气、种子、发酵液、泥土和污水的噬菌体浓度进行日常检查，即使空气中噬菌体浓度极低时，也要进行检测。,喷洒氯化物或杀藻胺(benzalkonium chloride)气溶胶能杀灭活噬菌体，紫外线照射用作一种额外的保护措施。漂白粉(0.2%)、阳离子表面活性剂（如季铵盐0.01%0.1%）和福尔马林（1%）均可单独使用，如果必要也可联合使用。,（2）选用抗噬菌体突变株,抗噬菌体突变株应具备以下特征：1）对以前出现过的噬菌体都具有抗性；2）为非溶源菌；3）具有与原始菌株相当或更高的生产能力；4）没有回复突变成噬菌体敏感株的能力。,对
12、付噬菌体污染的一个措施就是分离抗正在污染的噬菌体的细菌突变株，用于发酵生产上。,（3）使用抑制噬菌体复制的化学药物,药物必须具有以下性质： 选择性抑制噬菌体而不影响宿主菌生长或发酵过程； 在食品发酵工业上要求该化学物质不影响产品质量； 用量要小，要经济。, 有些噬菌体感染需要双价阳离子(Ca2+、Mg2+)吸附或DNA注射才能进行。使用络合剂可获得较好的效果，如0.2-0.3%多磷酸钠、0.1-0.2%肌醇六磷酸 (phytic acid)、0.2-0.5%柠檬酸或草酸等可抑制乳糖发酵短杆菌的噬菌体。, 非离子去污剂如聚乙烯二醇酯酸、聚羟乙烯烷基醚、吐温20、吐温60均能明显地抑制噬菌体吸附、复制，或引起流行性感染。, 有些抗生素能抑制多种噬菌体，氯霉素（1g/ml）对丙酮丁醇乳酸棒杆菌的HM噬菌体有良好的抑制作用，对宿主菌无影响。,
