1、核酸的定量与纯度的测定在分子生物学实验中，核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR 法和杂交定量法等。分光光度法分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。（1）紫外分光光度法紫外分光光度法基于 DNA 链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在 260nm 处有最大的吸收峰，蛋白质在 280nm 处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm 处。因此，可以用 260nm 波长进行分光测定核酸浓度， OD 值为 1 相当于大约50g/ml 双链 DNA，单链 DNA 浓度约为 33g / ml
2、，RNA 约为 40g/ml，寡核苷酸约为35g/ml。如用 1cm 光径，用 H2O 稀释 DNA/RNA 样品 n 倍并以 H2O 为空白对照，根据此时读出的 OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50OD260 读数 稀释倍数/1000RNA（mg/ml ）=40OD260 读数稀释倍数/1000。A280nm 是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8，纯 RNA 为 2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5 相当于 50%蛋白质/DNA 溶
3、液。A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值为 2.5。若比值小于 2.0 标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A320nm 或 A340nm 为检测溶液样品的浊度，该值应该接近 0.0。假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。实验步骤1、将制备的 DNA 悬浮溶解于 TE 缓冲液中 pH8.0，10mmo1/L 的 Tris 缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据 DNA 含量加水)。2、用可扫描的紫外分光光度计测定制备的 DNA/RNA 的紫外吸
4、收曲线，测定 OD260 和OD280，并计算比值：OD260/OD280，纯 DNA 的此比值约为 1.82.0。纯 RNA 的此比值约为大于 2.0。3、根据每毫升 1 微克的纯 DNA 的 OD260 值=0.020，计算所得 DNA 的纯度；每毫升 1 微克的纯 RNA 的 OD260 值= 0.025，计算所得 RNA 的纯度。注意事项OD 值范围应该在 0.10.99 之间，否则不符合上述线性关系。A260/A280 比值可提供 DNA 纯度的一个参考，但 A260/A280 比值会受 pH 影响。如果未调 pH，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在 10 mM Tri
5、s Cl，pH 8.5中检测，此时纯净的 DNA A260/A280 比值应为 1.8-2.0（注意应使用同样缓冲液作为对照）。常见问题分析1、DNA 浓度测定的 OD260/OD280 比值大于 1.8，说明存在 RNA，可重新用 RNaseA 处理，酚：氯仿：异戊醇（23：24：1）抽提；DNA 浓度测定的 OD260/OD280 比值小于 1.8，则说明有蛋白质等杂质存在，需再用蛋白酶 K、SDS 及盼、氯仿、异戊醇重新对 DNA 进行纯化（也可加入 1/8 体积的 3M NaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使 DNA 沉淀析出。RNA 浓度测定 OD260/OD280 比值小于 1.8
6、 时，说明溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显； OD260/OD280 比值大于 2.2 时，说明 RNA 已经水解成单核酸了。2、采用紫外检测法测核酸含量的优缺点：用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。3、样品中含有核苷酸类杂质：假如样品中蛋白质、核苷酸类物质较多可以通过离子层析柱进一步提纯，再用紫外吸收法测定。4、样品体系中其它物质对实验结果有干扰：蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫
7、外光。通常蛋白质的吸收高峰在 280nm 处，在 260nm 处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA 在 260nm 与280nm 处的吸收比值在 2.0 以上， DNA 的比值则在 1.9 左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。（2）定糖定磷法定糖定磷法是通过测定核酸中戊糖和无机磷含量实现对核酸含量的测定。该法无需特殊仪器，只需要将地衣酚、二苯胺及钼酸铵等与核酸样品反应，再通过分光光度计测定光吸收值即可定量核酸。但此法准确度差、灵敏度低、干扰物多、操作繁琐，在现今的研究中已较少采用。比如二苯胺法是利用脱氧核糖核酸中的 脱氧核糖在
8、酸性环境中变成 羟基 酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在 595nm 处有最大的吸收，在每毫升含 DNA20-400 微克范围内，光密度与 DNA 的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除 DNA 外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样的反应。1、DNA 标准曲线的制作取 8 支试管，编号，以一定的梯度依次加入不同浓度的 DNA 溶液和二苯胺试剂试剂。加毕，摇匀，于 60恒温水浴中保温 1 小时，（或于沸水中煮沸 15 分钟，冷却测0.D595nm 值）。以光密度为纵坐标，DNA 含量（ug/ml）为横坐标，绘制标准曲线。2、样品的测定取 2 支试管，各加 0.2-0
9、.5 毫升的待测液（内含 DNA 应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至 2 毫升，再加 4 毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度 DNA 的含量，按下式计算出样品中 DNA 的百分含量。DNA 含量/毫升待测液=标准曲线查得值稀释倍数注意事项1、二茉胺法测定 DNA 含量灵敏度不高，待测样品中 DNA 含量低于 50mg/L 即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定 DNA 的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。2、样品中含有少量 RNA 并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等
10、能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰 DNA 定理。（3）酶催化法基于酶催化的核酸定值方法是一种相对核酸定量法。其原理是染料能同时与酶和核酸结合，通过检测酶的催化活性即可实现对核酸的定量。此法的优点在于不需要通过核酸扩增，操作方便，使用的仪器简单。但该法实验中，酶的催化活性受多方面影响，难以达到最佳状态，会使定量结果出现偏差。荧光染料法荧光染料法是通过检测荧光试剂与 DNA 结合后的荧光强度变化而实现对核酸的定量。某些荧光探针试剂本身荧光强度不大，但与 DNA 结合后荧光强度大大增强，如：溴化乙锭在水溶液中的荧光量子产率很低，但它与 DNA 结合后，产生很强的荧光，激发波长显著红移；又如 H
11、oechst33258 是一种双苯并咪唑荧光染料，可高度特异地与双链 DNA 非嵌入性结合，结合后其荧光率由 0.01 增至 0.6。荧光染料法适用于样品中 DNA 或 RNA 含量较低或含有较多杂质的样品，绝对灵敏度很高.如利用 Hoechst33258 可测定纳克级水平的 DNA。PicoGreen 及 SYBR Green的检测灵敏度较 EB 和 Hoechst33258 更高，PicoGreen 可检测低至 0.25-0.5ng 的 DNA 样品。目前已有许多商品化核酸定量荧光染料，如 Invitrogen 公司用于测定双链 DNA 的PicoGreen、用于测定单链 DNA 的 Ol
12、iGreen 及用于测定 RNA 含量的 RiboGreen 等。含这些染料的核酸定量试剂盒被认为是目前对微量核酸定量较准确的方法。与紫外分光光度法相比，荧光染料法的应用尚不广泛它存在以下缺陷：（1）某些荧光染料（如 EB 等）具有极强的毒性和致诱变性；（ 2）荧光分析对环境因素极为敏感，易受温度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干扰；（3）该法需制作标准曲线，操作较复杂；（4）需专业的定量试剂盒，价格昂贵；（5）精确定量需依赖已知浓度的标准物质，而目前缺乏经过精确定值的标准物质，且少数现今采用标准物质（DNA）的定量方法为紫外分光光度法，这就产生潜在的偏差并使测量结果无法溯源到国际单位制。PCR
13、 法（1）PCR 电泳法PCR 技术检测简便快速、灵敏度高、特异性强、且扩增模式多样，常见的有套式PCR、竞争 PCR 及终点稀释法等。套式 PCR 通过嵌套引物的使用进一步增加了标准 PCR的特异性和灵敏度。终点稀释法通过梯度稀释待检样本及分别 PCR，直到扩增结果为阴性，依据稀释倍数计算起始靶基因的分子数。这种分析方法的优点是核酸的定量不依赖扩增效率，操作简便，灵敏度高。但每个样品需多次 PCR 反应，工作量大，且需获得稳定的 PCR 反应条件。无论是标准 PCR 还是改进的套式 PCR、竞争 PCR 及终点稀释法，反应产物均需进行电泳，而电泳图谱只能通过对比明亮度达到相对定量，其检测灵敏
14、度、特异性及定量准确性均较差，且易受多糖、蛋白等杂质及反应体系的影响。（2）PCR 产物微孔板杂交法PCR 产物微孔板杂交法结合了 PCR 技术、核酸杂交技术及酶联免疫技术，该法具有以下突出优点：检测灵敏度高于琼脂糖凝胶电泳；显色反应类似酶联免疫检测，特异性强；仪器容易操作，稳定性好，数据读取客观；杂交过程短，可以同时大量检测；可实现 PCR产物的定量或相对定量等。但该法操作步骤较繁琐，且放射性物质对人体有害。（3）实时荧光定量 PCRqPCR 技术由 Higuchi 于 1992 年提出，其原理是在标准 PCR 反应体系的基础上加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个 PCR
15、过程，最后通过标准品所建立的标准曲线对未知模板进行绝对定量或通过与内标准基因的对比进行相对定量。qPCR 技术因其既可定性又可定量、灵敏度高、动态范围广等优点而得到了广泛的认可和应用，已成为核酸定量的主流技术，其常用的荧光标记物质有 TaqMan 探针、MGB、SYBR、分子信标等。大量的科研工作使用 qPCR，每年产生大量的文章，但是在样品质量控制、实验设计、实验指标及实验结果描述等方面尚缺乏共识，使得各种存疑数据得以发表。（4）数字 PCRdPCR 是近年发展起来的一种可实现绝对定量的 PCR 技术。与传统 PCR 相比，数字PCR 以大规模集成流路芯片为基础，可将样品分到许许多多个单独的
16、区域进行 PCR 反应，反应结果报告“有”或“无” 。最后通过 PCR 循环数推算起始模板含量。因此，样品即便含有会产生干扰信号的杂质分子，但由于杂质分子不会发生 PCR 放大，其信号将不会影响最终检测结果。数字 PCR 不仅检测灵敏度高（可检测单个 DNA 分子） 、所需样本量少，且准确度好（误差可控制在 0.25%以内） 、无需标准物质对照，是一种潜在的基因定量标准方法研究人员已将其应用于疾病及转基因的检测。但该法的主要缺陷是所使用的仪器和耗材十分昂贵，难以在各实验室普及。总之，灵敏度和特异性均表现优秀的 PCR 技术检测是现今生物样品中微量核酸检测的现成、有效的方法。但是，PCR 扩增普
17、遍遇到的弊端是管与管之间的扩增重复性较差，即使是在最严格的控制条件下其重复性仍难以保证。重复性差的可能原因有仪器性能、反应条件、抑制剂的存在、样品制备差异、核酸纯化和模板的降解等。另外，还存在以下缺点：qPCR 及 dPCR 等耗材价格昂贵，很难普及；由于定量全过程封闭，不能监测扩增产物的大小；当引物特异性不高时，可能形成假阳性；RNA 反转录时各样品的误差太大等。杂交定量法杂交定量法主要包括：Southern 杂交、Northern 杂交、基因芯片、支链信号放大技术及 Rnase 保护技术。Southern 杂交特异性强，但操作复杂，灵敏度低。与 Southern 杂交类似的是用于检测RNA
18、 的 Northern 杂交技术，可用于基因表达量的比较研究。生物芯片是一种高通量的杂交定量技术。该技术以核酸杂交为基础，将短的寡核苷酸或 cDNA 序列高密度地固定在固相支持物的表面，然后加入已标记的目的序列进行杂交，之后检测荧光信号。由于荧光信号的强度与目标分子的数目成比例，从而实现核酸定量检测。支链信号放大技术采用了一种人工合成的、结构如同树枝的 DNA 信号放大探针分支链 DNA，其优点是：（1）只需将释放的核酸变性，样品处理简单；（2）不经过指数增长的扩增过程，避免了扩增产物污染及 PCR 抑制因素的影响；（3）可高通量检测病原体。但该方法成本较高，且当放大倍数低时，敏感性较差，检测
19、范围窄，不适用于 RNA的低浓度检测。RNase 保护技术由 Zinn 于 1983 年首次提出，此法的灵敏度高于 Northern杂交，但成本比较高、放射性同位素有致癌作用，且所转录成的 RNA 易降解，增加了实验误差。参考文献叶子弘，金荣愉，崔海峰. 2012. 核酸定量技术及其在生物检测中的应用 J. 中国计量学院学报，2012，23（1）：1-6马建岗.2001.基因工程学原理.西安：西安交通大学出版社吴乃虎.1998.基因工程原理，第 2 版（上册）. 北京：科学技术出版社J. 萨姆布鲁克，E.F . 弗里克，T. 曼妮阿蒂斯. 1992. 分子克隆实验指南，第二版. 金冬雁等译. 北京：科学技术出版社王娅，王哲，徐闯等. 2006.核酸定量方法研究进展J动物医学进展， 2006，27（7）：1-5
