1、CLP 致脓毒血症大鼠模型建立1、实验目的利用 CLP 技术建立脓毒血症大鼠模型2、实验原理脓毒血症患者最常见的感染源来自腹腔且易造成腹腔感染，所以腹腔感染模型是目前最常见的动物模型。鼠类盲肠结扎穿刺（CLP）是临床研究脓毒血症常见模型，是模仿腹腔脓毒血症感染的临床过程，引起多菌群感染，最终导致脓毒血症。3、实验材料和设备成熟期雄性 Sprague-Dawley 大鼠，体重 400-500g。外科手术器械：手术台，手术刀， 刀片，剪刀，刮毛器，镊子，止血钳，持针器，缝皮针，1 号线，4 号肠线，18g 针头，血管夹，医用胶布，PE50 导管（厂家），探针，硬膜外穿刺针，肝素帽，留置针，注射器（
2、规格）。实验药品：1.5%戊巴比妥钠，2%利多卡因，丁苯诺啡，75%酒精，碘伏，肝素钠（10000U），蒸馏水，生理盐水。4、实验方法和步骤1. 购买 SD 大鼠，适应性饲养 1 周，自由饮水，饮食；2. 术前禁食 12 小时；3. 称重以 1.5%戊巴比妥钠 40mg/kg（4%水合氯醛 0.1ml/10g 抽取麻药，一般 3-5 分钟起效，可以维持 1 小时左右。），腹腔注射（先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约 0.5 厘米，再使针头与皮肤呈 45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。），麻醉大鼠，
3、止血钳夹小鼠脚趾确定麻醉深度；4. 将大鼠背位固定于手术台上，剪去颈部和腹部被毛；5. 取血导管的制备：取 PE50 导管约 15cm，一侧剪契口，另一端平口，对楔 面 要 进 行 简 单 打 磨 处 理 ,以防表 面 粗 糙 划 破 血 管 外 壁 。 抗 凝 处 理 是 将 导 管 用装 满 肝 素 钠 的 注 射 器 灌 流 、 冲 洗 ,保 证 导 管 每 个 部 位 都 充 分 接 触 肝 素 钠 。6. 颈静脉置管术：a.用碘伏常规消毒颈部，铺无菌手术单。b.于胸锁乳突肌连线中点起向颈部垂直延伸 15mm,做皮肤切口约 1.5cm，暴露皮下结缔组织，用血管钳逐层钝性分离至显露颈静脉
4、(特征是在胸廓入口处，有轻微搏动，直径 24 mm)，2%利多卡因 3-5 滴局部浸润 1min，完全游离一段长 1-1.5cm 血管，血管夹分别夹闭远心端和近心端，血管下穿过两根 1 号线。c.在游离颈静脉中间部位，用镊子提起血管壁，全层剪一“V”形小口，约占静脉的 1/3。预先植入探针，再将导管沿切口缓慢送入静脉切口，轻轻开放近心端的血管夹，将导管植入 2.5-3cm，可见有血回流或回抽有血。1 号线结扎固定导管，松紧适宜，再次回抽，确定导管在血管内，结扎远心端，开放远心端血管夹。d.将导管连同附近少许肌肉缝合固定 2-3 针，连续缝合切口，留 0.5cm 切口，以便导管穿过颈部，固定在颈
5、部背侧。e.导管固定：将大鼠将大鼠翻身置于实验台上，颈后部备皮、消毒，剪一小口，用硬膜外穿刺针沿皮下穿至颈部切口处，拔出针芯，将导管置入穿刺针中，在其引导下，从颈背部穿出，皮肤外留约 2cm，连接接头，回抽，确定无误后，将充满肝素盐水的导管接头和肝素帽接好，在颈背部用 4 号线缝合 34针固定。缝合剩余切口，并用 75%酒精消毒。7. 将大鼠仰卧位固定在手术台上，腹部备皮，碘伏常规消毒，铺无菌手术单。8. 用手术刀于下腹部正中央，做一 1-1.5cm 纵行切口。9. 逐层打开肌层、筋膜、腹膜层。10. 找到盲肠一般位于腹部左侧，小心分离其远端及大肠系膜，用钝镊小心取出。11. 于盲肠末端 1/
6、4 处，用 4 号肠线行结扎术，用 18-gauge needle 穿孔 2 个，需避开回盲部，将内容物挤出少部分，保证孔的通畅性，将肠内容物推至盲肠末端。12. 回纳盲肠至腹腔，关腹。单纯连续缝合腹膜筋膜肌肉，间断缝合皮肤。13. 用预热的生理盐水（37，5ml/100g）皮下注射14. 注射丁苯诺啡（0.05mg）皮下，止痛，可每 6h 一次。15. 用注射针头接 1ml 注射器于下腹部耻骨联合之上，腹正中线穿刺。取钝角进针，针头穿过皮肤后稍微改变角度，以避免穿刺后漏尿，然后刺向膀胱方向，边缓慢进针边回抽，直到抽到尿液为止。16. 大鼠复苏后将大鼠分成二个亚组颈静脉取血（A 亚组：CLP
7、0、 12、24、48 小时后取血；B 亚组：CLP 3、6、18 及 72 小时后取血），同时所有大鼠通过膀胱穿刺取尿回笼子，活动在 22-25环境下，食物和水不受限制。刺法留取尿液标本。4、注意事项1.AB 分组并非对照实验组，而是为了避免大鼠失血少于 20%，引发休克，采取的分组取血，每次取血留样为 0.8ml，保存温度为：-80。2.该实验确定 AKI 程度为 RIFLE 标准，在同等时间点时，取血测定肌酐值，需要多少的血液标本才能测定，RIFLE 标准：轻度: RIFLE-R， 肌酐为基础值的 150%；中度：RIFLE-I， 肌酐为基础值的 200%；重度：RIFLE-F， 肌酐为基础值的 300%。3.血液标本是用血清测量？：取静脉血 5ml，室温静置 30min,4离心机3000R 离心 15min，取上层血清，-80保存。用什么管子保存标本。4.血清保存管是否需要抗凝，抗凝剂用什么。血清肌酐，目前拟定不需要抗凝，取血清样本测肌酐。5.种鼠对实验是否有影响，实验室只有 5-6 周龄大鼠，100-150g 左右，种鼠有老年期大鼠，400-500g。
