1、 microRNA 论文：microRNA 对多巴胺能神经元分析化基因的调节作用【中文摘要】帕金森氏病(Parkinsons disease, PD)是由于缓慢发生的中脑黑质多巴胺能神经元选择性死亡和纹状体多巴胺含量显著减少所导致,PD 已成为发病率高居第二的神经系统退行性疾病。显而易见,多巴胺能神经元(dopaminergic neuron, DA neuron)数量的锐减导致其所释放的 DA 递质含量不足,进而引起运动失调,是 PD 产生的根本原因。所以,通过合适的途径调控体内 DA 神经元的数量,从而恢复神经递质平衡是治疗 PD 的关键所在。microRNAs(miRNAs)是一类长度约
2、为 20-25nt 的内源性非编码小分子RNA,可通过与靶 mRNA 的 3UTR 区互补配对而在转录后水平负调控基因表达。近期的众多研究都着眼于此类小分子 RNA 家族在疾病产生及治疗方面的重要作用。本文基于现有的研究基础,将三个与多巴胺能神经元分化相关的关键基因Lmxla、Msx1 和 Nr4a2/Nurrl作为研究对象。利用 Microcosm Targets、MicroRNA.org、TargetScan 和 miRDB 等四款 miRNA 在线分析软件进行生物信息学预测,搜索筛选出对三个靶基因具有调控作用的 miRNAs,再经过萤光素酶双报告基因检测(Dual-luciferase
3、assays system)和 Western Blotting 对软件预测结果进行实验验证,结果小结如下：1、通过文献查找,选定 Lmxla、Msx1 和 Nr4a2/Nurr1三个与多巴胺能神经元分化密切相关的基因作为研究对象。以这三个基因的 3UTR 为靶序列,在四款 miRNA 数据库中进行生物信息学预测,搜索出可能调控这三个靶序列的 miRNAs。选取四款软件或至少三款软件均能预测到的 miRNAs 作为候选 miRNAs。其中,预测对Lmx1a 有作用的 miRNAs 有 3 个；预测对 Msx1 有作用的 miRNAs 有 4个；预测对 Nr4a2/Nurr1 有作用的 miRN
4、As 有 13 个。2、克隆Lmxla、Msx1 和 Nr4a2/Nurr1 三个靶基因 3UTR 序列到 psiCHECK-2载体中,克隆 miR-9、miR-19b、miR-19a、miR-17、miR-20a、miR-106b、miR-211、miR-206、miR-183、miR-34a、miR-467b、miR-144、miR-374、miR-29a、miR-30e、miR-30b、miR-384-5p,17 个miRNAs 到 T 载体中。3、利用小鼠的胚胎神经干细胞作为转染对象,共转染已构建的候选 miRNAs 及携带靶基因 3UTR 序列的萤光素酶双报告基因载体。利用 Dual
5、-luciferase assays system,分析海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的表达水平,发现预测的 miRNAs 中,除miR-206/Nr4a2、miR-467b/Lmxla、miR-374/Msx1 三个实验组无差异显著的结果外,其他 miRNAs 均与预测结果一致,对靶基因 3UTR具有明显抑制作用。4、利用小鼠的胚胎神经干细胞作为转染对象,单独转染已构建的候选 miRNAs 载体,提取蛋白进行 Western Blotting 检测。发现 Nr4a2 组的各 miRNAs 都能够显著降低靶基因的蛋白水平,进一步证实了预测结果。而 Lmxla 和 Msx1 纽的抑制效果没有
6、Nr4a2 组明显。经过上述验证,我们可以肯定 miRNA 参与调控多巴胺能神经元分化相关基因的表达,并通过靶向这些基因而间接调节多巴胺能神经元的分化,从而参与帕金森氏病的发生。本研究不但证实了 miRNA 与帕金森氏病病的发生之间存在莫大的联系,还为帕金森氏病病的治愈及新药的研发提供了一个新思路。【英文摘要】Parkinsons disease is caused by the slowing selective death of dopaminergic neurons in the substantia nigra, and the significant reduction of do
7、pamine levels in the striatum of PD patients.The incidence of PD had become the second hightest neurodegenerative diseases in the world.Obviously,insufficient release of dopamine transimitter caused by the major decrease of dopaminergic neurons resulting in the motor ataxia,is a radical reason of PD
8、. Consequently,find a proper way to regulate the number of dopaminergic neurons and to restore the neurotransmitter levels in vivo is the key to cure PD.microRNAs (miRNAs) are 20-25 nt, endogenous non-coding small molecule RNA family that posttranscriptionally regulate gene expression through base p
9、aring to the 3UTR of target gene. Many studies have focused on the fundamental role of these small molecules during the development and treatment of diseases.Based on the published researchs, we found three key genesLmxla, Msxl and Nr4a2/Nurrl that are highly associated with differentiation of dopam
10、inergic neurons. Therfore, we utilized Microcosm Targets, MicroRNA.org, TargetScan. and miRDB four miRNA on-line analysis softwares for bioinformatics assay and predicted miRNAs that could regulate the three target genes. Finally, we validated the role of these miRNAs by Dual-luciferase assays syste
11、m and Western Blotting. The results are summarized as follows:1 We chose Lmxla, Msxl, Nr4a2/Nurrl three genes, which are functional during differentiation of dopaminergic neurons, as the objects of our study. The potential miRNAs that could regulate these genes were predicted by four miRNA on-line a
12、nalysis softwares. miRNAs could be predicted in at least three or four softwares are selected as candidate miRNAs.Actually,there are 3 miRNAs target Lmxla,4 miRNAs target Msx 1,13 miRNAs target Nr4a2/Nurr1.2 The 3UTR sequence of three target genes were cloned into psiCHECK-2 vectors,and totally 17 m
13、iRNAs, miR-9, miR-19b, miR-19a, miR-17, miR-20a, miR-106, miR-211, miR-206, miR-183, miR-34a, miR-467b, miR-144, miR-374, miR-29a, miR-30e, miR-30b and miR-384-5p were cloned into T-Vectors, respectively.3 The candidate miRNAs and 3UTR sequence of the target genes which had been cloned into dual-rep
14、orter luciferase vectors are co-transfected into mouse embryonic neural stem cells. Luciferase activity was measured using a GloMaxTM-Multi+ Mircroplate Luminometer and the Renilla luciferase counts were then normalized to Firefly luciferase counts.We find that among all the predicted miRNAs,only mi
15、R-206/Nr4a2, miR-467b/Lmxla,miR-374/Msxl show no significant differences, while others are consistent with the prediction.4 After transfecting mouse embryonic neural stem cells by the candidate miRNAs, the expression of Nr4a2, Lmxla and Msxl were detected by Western Blotting. We find that all the mi
16、RNAs of Nr4a2 group can significantly reduce the protein levels, but the inhibitory effect of Lmxla and Msxl groups did not show obvious effect compared to Nr4a2 group.Our work verify miRNAs fundamental role in the regulation of differentiation-related genes of dopaminergic neurons, which not only c
17、onfirmed the great link between miRNA and the incidence of Parkinsons disease, but also provides a new idea for the treatment of Parkinsons disease and the development of new drugs.【关键词】microRNA 多巴胺能神经元 生物信息学预测 萤光素双报告基因检测 Western Blotting【英文关键词】microRNA dopaminergic neurons bioinformatics predicted
18、Dual Luciferase Reporter Gene Assay Western Blotting【目录】microRNA 对多巴胺能神经元分析化基因的调节作用 摘要 3-5 Abstract 5-6 第 1 章 引言 11-21 1.1 立题的背景和意义 11-12 1.2 帕金森氏病的介绍 12-14 1.2.1 帕金森氏病的发病机制及病理特征 12 1.2.2 多巴胺及多巴胺能神经元 12-14 1.2.3 多巴胺能神经元相关的分化基因 14 1.3 microRNA 的介绍 14-21 1.3.1 microRNA 的发现 15 1.3.2 microRNA 的生物合成机制 15
19、-16 1.3.3 microRNA 的特征 16-17 1.3.4 microRNA 的作用机制及靶基因预测 17-19 1.3.4.1 microRNA 的作用机制 17-18 1.3.4.2 microRNA 靶基因预测 18-19 1.3.5 microRNA 对帕金森氏病的影响 19-21 第 2 章 材料与方法 21-29 2.1 材料与试剂 21-27 2.1.1 仪器和设备 21-22 2.1.2 试剂和耗材 22-23 2.1.3 引物和测序 23-25 2.1.4 动物、细胞和质粒 25-27 2.2 计算机分析 27-29 第 3 章 实验方法 29-49 3.1 实验技
20、术路线 29 3.2 靶基因的确定及对其具有调控作用的 miRNA 预测 29 3.3 靶基因克隆 29-37 3.3.1 小鼠神经干细胞(NPC)的培养 29-31 3.3.2 PCR 扩增靶基因及琼脂糖凝胶电泳检测 31-32 3.3.3 靶基因割胶回收 32-33 3.3.4 靶基因与载体 PsiCHECK-2 的酶切和酶连 33-35 3.3.5 转化 35 3.3.6 单克隆菌落培养及测序 35 3.3.7 克隆菌落测序结果比对及质粒提取、鉴定 35-37 3.4 miRNA 克隆 37-41 3.4.1 lenti-137 质粒提取(BIOMIGA 质粒小提试剂盒) 37-38 3
21、.4.2 PCR 扩增miRNA 及琼脂糖凝胶电泳检测 38-39 3.4.3 纯化产物加 A 尾 39 3.4.4 miRNA 的 TA 克隆及重组质粒转化大肠杆菌 39-40 3.4.5 单克隆菌落培养及测序 40 3.4.6 miRNA 单克隆菌落测序结果比对及质粒提取、鉴定 40-41 3.5 细胞转染 41-43 3.5.1 小鼠神经干细胞(NPC)的培养 41 3.5.2 小鼠神经干细胞(NPC)的贴壁培养 41-42 3.5.3 靶基因和 miRNA 共转染 NPC 42-43 3.5.4 luciferase 检测(Promega) 43 3.6 Western Blottin
22、g 检测靶基因目的蛋白表达 43-49 3.6.1 小鼠神经干细胞(NPC)的培养 43 3.6.2 小鼠神经干细胞(NPC)的贴壁培养 43-44 3.6.3 miRNA 转染 NPC 44-45 3.6.4 Western Blotting 检测 45-49 第 4 章 结果与分析 49-65 4.1 生物信息学预测对靶基因具有调控作用的 miRNA 49-55 4.1.1 Microcosm Targets database 预测结果 49 4.1.2 MicroRNA.org预测结果 49-50 4.1.3 TargetScan.预测结果 50-51 4.1.4 miRanda 预测结
23、果 51-55 4.1.5 初步筛选 miRNA 作为候选研究对象 55 4.2 靶基因克隆 55-59 4.2.1 小鼠 NPC 培养图谱 55-56 4.2.2 基因组 DNA 的提取 56-57 4.2.3 靶基因的 PCR扩增 57 4.2.4 靶基因的单克隆菌液测序结果比对 57-58 4.2.5 靶基因阳性克隆的质粒提取 58-59 4.3 miRNA 克隆 59-61 4.3.1 miRNA 的 PCR 扩增 59-61 4.3.2 miRNA 阳性克隆的质粒提取 61 4.4 萤光素双报告基因检测 61-63 4.4.1 神经干细胞(NPC)的贴壁培养 61-62 4.4.2 靶基因和 miRNA 共转染后 Luciferase 检测结果 62-63 4.5 Western Blotting 检测目的基因表达 63-65 第 5 章 讨论 65-67 5.1 生物信息学预测方法在 RNA 组学研究中的可行性 65 5.2 DA 神经元相关分化基因与 miRNAs 之间存在相关性 65-66 5.3 以 miRNAs 为靶标治疗疾病的希望 66-67 致谢 67-68 参考文献 68-72 攻读学位期间的研究成果 72
