1、鼻用人参皂苷 Rg3 壳聚糖微球的制备第二军医大学学报?2008 年 7 月第 29 卷第 7 期?http:/AcademicJournalofSecondMilitaryMedicalUniversity,Jul.2008,Vol.29,No.7?817?DOI:10.3724/SP.J.1008.2008.00817?论?著?唐文燕,高? 静,丁雪鹰,高?申*第二军医大学药学院药剂学教研室,上海 200433摘要?目的:以壳聚糖为载体材料,人参皂苷 Rg3 为模型药物,制备鼻腔给药微球。方法:采用复乳化化学交联技术制备人中图分类号?R943.43?文献标志码?A?文章编号?0258-87
2、9X(2008)07-0817-05PreparationofGinsenosideRg3-loadedchitosanmicrospheresforintranasaladministrationTANGWen-yan,GAOJing,DINGXue-ying,GAOShen*DepartmentofPharmaceutics,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,ChinaABSTRACT?Objective:ToprepareginsenosideRg3-loadedchitosanmicrosph
3、eresforintranasaladministration.Methods:ThechitosanmicrosphereswerepreparedbytheO/W/Ocombinedwithmultipleemulsificationchemicalcrosslinktechnique.Quadraticpolynomialequationandlinearregressionequationwerefittedbythestatisticsoftware,andtheresultingequationswereusedtoproduceresponsesurfacegraphs.Theb
4、estexperimentconditionswerescreenedbycentralcompositedesign(CCD)usingdrugload,encapsulationefficiency,andtheproportionsofmicrospheres(withdiameterof40-60?m)asvariables.Theshapeofmicrosphereswasobservedbyscanningelectronmicroscope.Results:Thebestrangesoftheprescriptionincluded:drugtocarriermaterialra
5、tio:0.4-0.5;organicphaseandwaterphaseratio:0.4-0.6;andfirstemulsionandoilphaseratio:0.13-0.17.The3batchesofmicrospherespreparedaccordingtotheaboveconditionwerewell-shaped(fullsphere),withthemeandrugloadingcapacitybeing(10.25?0.08)%andtheencapsulationefficiencybeing(30.61?1.46)%.Conclusion:Theoptimiz
6、edtechniquehasagoodreproducibilityandcanbeusedforpreparationofRg3-loadedchitosanmicrospheresforintranasaladministration.KEYWORDS?ginsenoside;chitosan;microspheres;drugpreparation;drugdesignAcadJSecMilMedUniv,2008,29(7):817-821?人参皂苷 Rg3 是存在于天然药物人参中的一种四环三萜皂苷,具有多方面的药理作用,如抗肿瘤1-2、神经保护3 、促进记忆4、抗血管增生5等。但是人
7、参皂苷 Rg3 人口服后血浆浓度很低,3.2mg/kg 口服后的 cmax 值仅为(16.0?6.0)ng/ml,tmax 值仅为(0.66?0.10)h6。一般认为,口服后血药浓度很低的原因大致有三:一是口服后经胃肠道吸收的药量少;二是口服后进入胃肠道内的药物被其中的酶或肠道细菌所代谢;三是药物虽可被胃肠黏膜收稿日期?2008-01-28?接受日期?2008-03-26吸收,但被肠壁或肝脏的酶所代谢,即首过效应。?鼻腔可作为药物吸收部位,因为鼻黏膜上有大量的细微绒毛 ,可大大增加上皮细胞的药物吸收面积,上皮细胞下分布着丰富的血管网 ,流经鼻腔的静脉血不经过肝脏可直接进入体循环7;鼻腔中 pH
8、 为 6.57.1,对药物吸收影响很小;分子量较大的药物也可通过鼻黏膜吸收。因此,鼻黏膜给药特别适合在胃肠道不稳定、在胃肠道内不易被吸收或首过作用强的药物。但鼻腔中纤毛的正常生理摆动能将基金项目?全军医药卫生科研基金(2006172006).SupportedbyMedicalandHealthResearchFundsofPLA(2006172006).作者简介? 唐文燕 ,硕士.E-mail:*通讯作者(Correspondingauthor).Tel:021-25070392,E-mail:?818?第二军医大学学报?2008 年 7 月,第 29 卷滴入的药物很快清除,影响药物吸收。若
9、将药物制成亲水性凝胶微球制剂,能延长药物在鼻腔中滞留时间8-9,以提高药物的吸收。?本文采用具有生物黏附性和吸收促进作用的壳聚糖(chitosan) 作为载体材料,制备了鼻黏膜用人参皂苷 Rg3 壳聚糖微球。1?材料和方法1.1?药品、试剂及仪器?人参皂苷 Rg3(大连富生药业有限公司,纯度 93.58%,批号:070221);壳聚糖( 南通生物制品有限公司,100 目, 脱乙酰度 91.72%);液体石蜡(国药化学试剂),化学纯;甲醛( 国药化学试剂), 分析纯;乙腈 (JKChemical.Ltd.),色谱纯;其余试剂均为分析纯。剪切乳化搅拌器(上海标本模型厂);磁力搅拌器( 上海梅颖浦仪
10、器仪表制造有限公司);光学显微镜(EUROMEX,Holland);S-520 型扫描电镜(日本日立);LC-10A 型高效液相色谱仪(日本岛津) 。1.2?壳聚糖微球的制备?以复乳法10-11为基础制备 Rg3 壳聚糖微球,取处方量壳聚糖溶于 5%醋酸溶液中形成水相。将 Rg3 溶解于二氯甲烷中形成有机相,将有机相滴入水相中超声制得初乳 ;以液体石蜡(含 2%Span80)作为油相 ,将初乳滴入油相搅拌制成复乳;搅拌30min 后,加甲醛固化 ,固化 3h 后,静置,倾去油相,沉淀经石油醚洗涤,无水乙醇脱水,真空干燥即得。1.3?Rg3 含量测定方法的建立及方法学考察 1.3.1?色谱条件?
11、DiamondODS 色谱柱(200mm?4.6mm,5?m); 流动相:乙腈?水(55?45);流速 1ml/min;检测波长 203nm;室温进样;进样量20?l。 1.3.2?标准曲线的绘制?分别配制1、2.5、5、10、25、50、100?g/ml 的 Rg3 系列标准溶液, 按 1.3.1色谱条件分析,测定峰面积,以浓度对峰面积回归得到标准曲线。1.3.3?精密度试验? 配制低、中、高(25、50、100?g/ml)3 种浓度 Rg3 溶液,分别按 1.3.1 项下色谱条件分析, 测其峰面积。1d 内测定5 次及每天测定 1 次,连续 5d,计算日内与日间精密度。1.3.4?回收率试
12、验? 精密称取空白微球 9 份,每 3 份为一组,分别加入低、中、高(25、50 、100?g/ml) 浓度的 Rg3 溶液,加稀硝酸溶液(1?5)4ml 于 70?水浴消解 30min,放冷,再用甲醇定容至 10ml,用0.45?m 微孔滤膜过滤后用流动相稀释到适当倍数, 按 1.3.1 项下色谱条件分析,测定峰面积,代入标准 1.4?包封率和载药量的测定?取含药微球约 50mg,精密称定后置于 10ml 容量瓶中 ,按 1.3.4 项下回收率试验方法处理,按 1.3.1 项下色谱条件测定 Rg3 浓度, 根据下列公式计算每一处方微球的载药量和包封率。载药量=微球中药物量/微球重量?100%
13、;包封率=微球中药物量/投药量?100%。1.5?微球的粒径及形态考察?在带标尺的光学显微镜下观察干态微球的球形及分散性,选择具有代表性的区域,测定 500 个微球, 计算平均粒径。将干态微球均匀散在样品平台上,用导电胶固定后溅金 ,用扫描电镜观察微球表面形态。1.6?星点设计优化微球制备工艺?在预实验的基础上,选择对Rg3 壳聚糖微球性质影响较显著的 3 个因素为考察对象,即投药比(X1)、有机相与水相比(X2)、初乳与油相比(X3)。采用三因素五水平表(表 1),以包封率(Y1) 、载药量(Y2)和 4060?m 粒径微球所占比例 (Y3)为评价指标,并作为因变量, 分别对各因素、各水平用
14、 Statistic 软件进行二项式拟合。经逐步回归计算,求得复相关系数较高的目标函数 ,固定 3 个自变量之一为中值,其他 2 个自变量为横坐标,并绘制效应面(responsesurface)图, 由图选取较佳工艺条件,并按优化的工艺条件制备 3 批微球。表 1?星点设计优化微球制备工艺的因素水平表Tab1?IndependentvariablesandcorrespondentvaluesincodedandphysicalformofCCDIndependentvariableX1(W/W)X2(V/V)X3(V/V)Level-1.6820.50.5-10.70270.70270110
15、.111.59451.59450.15951.682220.20.06670.0802?X1:Drugandcarriermaterialratio;X2:Organicphaseandwaterphaseratio;X3:Firstemulsionandoilphaseratio2?结?果2.1?Rg3 含量测定 HPLC 法的方法学考察结果 2.1.1?标准曲线?回归方程为:C=0.0007A-2.5253(r2=0.9993),表明浓度在 1100?g/ml 范围内线性关系良好。HPLC 图谱见图 1。在此色谱条件下 ,Rg3 的保留时间为 5.3min 左右。各组分峰分离效果好,空白微
16、球不干扰 Rg3 微球的测定。2.1.2?精密度与回收率? 结果见表 2。Rg3 壳聚糖微球的回收率在 98%102%之间, 而日内日间精密度均小于 2%,表明该含量测定方法回收率和精密度符合要求。?819?2.2?Rg3 微球制备工艺优化结果?见表 3。? 二项式回归方程及其复相关系数如下:?Y1=-15.20445-39.12614X1+17.69138X2+723.28081X3+11.37559X21-28.77773X22-2279.19745X3+9.56869X1X2-61.25310X1X3-14.57971X2X3(r=0.8315)?Y2=-9.61607-9.24557X
17、1+4.58785X2+295.57791X3+1.89888X1-3.65380X2-图 1?Rg3含量测定 HPLC 色谱图Fig1?ChromatographyofRg3contentdeterminationA:Non-loadedmicrosphere;B:Rg3standardsolution;C:Rg3-loadedmicrosphere22986.18820X3+6.20663X1X2-18.07232X1X3+3.34036X2X3(r=0.7724)?Y3=53.86277+27.99942X1+9.91994X2-2428.67169X3-7.24955X21-5.707
18、73X2+23693.33211X23+0.23814X1X2-101.97252X1X3-316.16971X2X3(r=0.8558)?从拟合方程的复相关系数可见,3 个方程采用二项式方程拟合效果较好,3 个因素对包封率、载药量及粒径均有影响。?分别以 Y1、Y2、Y3 值为因变量,固定影响最小的自变量为中值,相对于另 2 个自变量的效应面三维图见图 24。表 2?方法回收率与精密度结果Tab2?RecoveryandprecisionofHPLCConcentration-1)?B/(?g?ml2550100Recovery/%(n=3)98.97?0.3399.53?0.72101.1
19、2?0.39Inter-dayRSD/%0.9180.8830.827Intra-dayRSD/%1.071.331.29表 3?星点设计优化微球制备工艺结果Tab3?ExperimentaldesignwithexperimentallydeterminedvaluesofdifferentdependentvariablesNo.123456789101112131415-20X10.70271.59450.70271.59450.70271.59450.70271.59450.5211111X20.70270.70271.59451.59450.70270.70271.59451.594
20、5110.52111X30.08020.08020.08020.08020.15950.15950.15950.15950.10.10.10.10.06670.20.1Y1/%(n=3)11.93?0.2011.57?0.2721.71?0.3217.98?0.9228.96?0.1912.20?0.5227.36?1.1823.40?0.5028.26?1.709.62?0.139.75?0.2412.28?0.658.78?0.819.51?0.8410.77?0.55Y2/%(n=3)4.92?0.737.11?0.918.96?0.4611.05?0.1011.95?0.247.50?
21、0.6811.29?0.2514.38?0.559.42?0.386.41?1.984.87?1.026.14?0.244.39?0.134.76?0.125.38?0.48Y3/%(n=3)46.00?6.0835.67?6.110063.67?14.4746.33?12.580020.33?5.7740.00?7.8130.33?13.3210.00?7.0058.33?9.4556.33?14.0140.33?12.22?X1:Drug/chitosan;X2:Organicphase/waterphase;X3:Firstemulsion/oilphase;Y1:Encapsulati
22、onefficiency;Y2:Drugloadingcapacity;Y3:Ratioof40-60?mmicrospheres?820?第二军医大学学报?2008 年 7 月,第 29卷?根据效应面优选的较佳处方范围为Xl:0.40.5;X3:0.130.17。其中有机相与水相比对处方影响较小,则选取原则为刚好能溶解药物的有机溶剂量 ,取 X2 范围为 0.40.6。即较佳处方为:投药比(X1):0.45;有机相与水相比(X2):0.5;初乳与油相比(X3):0.15。照此条件制备的 3 批 Rg3 壳聚糖微球, 其平均包封率、载药量和 4060?m 微球所占比例的数据结果见表 4。图 2
23、?包封率(Y1)对投药比(X1)及初乳与油相比(X3)的预测效应面图Fig2?ResponsesurfaceofencapsulationefficiencyasafunctionofX1andX3OrganicphaseandwaterphaseratioX2=1ParameterY1Y2Y3?a:表 4?优化处方制备 Rg3 微球实测值与预测值的比较Tab4?Predictedandmeasuredvaluesofmicrospherespreparedaccordingtooptimalexperimentalconditions(%)Predicted30.2810.5656.78Me
24、asured(n=3)30.61?1.4610.25?0.0852.00?3.00Variancea-1.092.948.42Variance(%)=(predictedvalue-measuredvalue)/predictedvalue?100%.Y1:Encapsulationefficiency;Y2:Drugloadingcapae-ity;Y3:Ratioofmicrophereswhichsizebetween40?mand60?m?由表 4 可见, 包封率、载药量及 4060?m 微球图 3?载药量(Y2)对投药比(X1)及初乳与油相比(X3)的预测效应面图 Fig3?Resp
25、onsesurfaceofdrugloadingcapacityasafunctionofX1andX3OrganicphaseandwaterphaseratioX2=1所占比例得到的实测值与预测值偏差均较小,表明优选处方的制备工艺较为稳定。重复 3 次测定所得结果的平均值与预测值很接近,表明所得的拟合方程可以较好地描述指标与因素之间的关系。由光镜可见微球球形圆整,分散性良好,粒径大小均匀。图 5为粒径分布直方图。图 5?粒径分布直方图图 4?4060?m 微球所占比例(Y3)对投药比(X1)及初乳与油相比(X3)的预测效应面图Fig4?Responsesurfaceofproportion
26、of40-60?mmicrospheresasafunctionofX1andX3OrganicphaseandwaterphaseratioX2=1Fig5?SizedistributionofRg3-loadedchitosanmicrospheres?其中 4060?m 的微球占总数的 52.0%,微球平均粒径为(44.99?12.59)?m。?821?图 6 为载药微球的扫描电镜(SEM)图片,由图片可见,微球表面较粗糙,球形圆整, 形态良好, 含药微球表面有很多微小孔洞,可能是复乳法制备时溶解药物的有机溶剂挥发排走后形成的。支气管,而当粒径很大时,微球主要分布在外鼻腔非纤毛区,药物吸
27、收差。因此,鼻黏膜给药微球的粒径最好在 4060?m 范围内14,本研究制备的 Rg3 壳聚糖微球平均粒径为(44.99?12.59)?m,4060?m 的微球占总数的 52.0%,符合此要求。参考文献1?ParkIH,PiaoLZ,KwonSW,LeeYJ,ChoSY,ParkMK,etal.CytotoxicdammaraneglycosidesfromprocessedginsengJ.ChemPharmBull,2002,50:538-540.2?KeumYS,HanSS,ChunKS,ParkKK,ParkJH,LeeSK,etal.Inhibitoryeffectsofthegin
28、senosideRg3onphorbolester-inducedcyclooxygenase-2expression,NF-?BactivationandtumorpromotionJ.MutRes,2003,523-524:75-85.3?KimS,NahS,RhimH.Neuroprotectiveeffectsofginsengsapo-ninsagainstL-typeCa2+channel-mediatedcelldeathinratcorticalneuronsJ.BiochemBiophysResCommun,2008,365:399-405.4?张?晶, 王世荣, 陈全成,L
29、ongPH,KangJS.人参皂苷 Rg3(R),Rg3(S),Rg5/Rk1 对乙醇致小鼠记忆阻碍改善作用的影响J.吉林农业大学学报,2006,28:283-284.5?YuePYK,WongDYL,WuPK,LeungPY,MakNK,Ye-ungHW,etal.Theangiosuppressiveeffectsof20(R)-ginsen-osideRg3J.BiochemPharmacol,2006,72:437-445.6?庞?焕, 汪海林,富?力,苏成业.20(R)-人参皂苷 Rg3 人体药代动力研究J.药学学报,2001,36:170-173.7?CostantinoHR,Il
30、lumL,BrandtG,JohnsonPH,QuaySC.In-tranasaldelivery:physicochemicalandtherapeuticaspectsJ.IntJPharm,2007,337(1-2):1-24.8?GaviniE,RassuG,MuzzarelliC,CossuM,GiunchediP.Spray-driedmicrospheresbasedonmethylpyrrolidinonechitosanasnewcarrierfornasaladministrationofmetoclopramideJ.EurJPharmBiopharm,2008,68:2
31、45-252.9?WangJ,TabataY,MorimotoK.Aminatedgelatinmicrospheresasanasaldeliverysystemforpeptidedrugs:evaluationofinvitroreleaseandinvivoinsulinabsorptioninratsJ.JControlRel,2006,113:31-37.10敦洁宁, 邓树海 ,苗彩云,张?娜.大蒜素壳聚糖微球的研究J.山东大学学报(医学版),2005,43:452-454.11吴婉莹, 李云谷 .金雀异黄素壳聚糖微球的制备方法 J.中国中药杂志,2002,27:353-355.1
32、2ZhangX,ZhangHJ,WuZM,WangZ,NiuH,LiC.Nasalab-sorptionenhancementofinsulinusingPEG-graftedchitosannanoparticlesJ.EurJPharmBiopharm,2008,68:526-534.13吴?伟,崔光华.星点设计-效应面优化法及其在药学中的应用J.国外医学:药学分册,2000,27:292-298.14陈建明, 毛世瑞 ,毕殿洲.褪黑激素明胶微球的鼻腔给药J. 药学学报,2000,35:786-789.图 6?含药微球扫描电镜照片Fig6?SEMphotographyofRg3-loade
33、dchitosanmicrospheresA:Singlemicrophere;B:Microspheres.Originalmagnification:?1500(A);?1000(B)3?讨?论?壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基后得到的一种天然高分子氨基多糖,是唯一在自然界存在的碱性多糖 ,分子中含有大量游离的氨基和羟基,可与黏液中的糖蛋白形成氢键而产生黏附作用 ,因此具有良好的生物吸附性,同时分子结构中带正电荷 ,可与带负电荷的黏膜相互作用打开细胞间紧密连接接口,促进药物胞间转运12,所以可增强药物的透膜能力,是良好的黏膜吸收促进剂。?在星点设计时,如果采用多指标优化实验 ,各指标的优选条件可能
34、会相互矛盾,即对某一指标有利的条件可能对其他指标不利 ,这时,可采用综合指标(overalldesirability,OD)来考察指标的综合效果13。由于本实验中的 3 个指标均为欲达到最大化的指标, 对因素水平的选择趋势一致,因此不再采用 OD 来优化工艺。?星点设计是多因素五水平的实验设计, 是在二水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成的,通常实验表是以代码的形式编排的,实验时再转化为实际操作值,一般水平取值为 0、?1、?,其中1/40 为中值,?为极值,?=(F),F 为析因设计部分实验次数,F=2(k 为因素数),所以三因素的?=(2)=1.682。?鼻黏膜给药微球的粒径对药物在鼻腔中分布影响较大。当粒径小于 10?m 时,微球会随气流进入31/413k本文编辑?尹?茶
