1、基因（分子）诊断：采用分子生物学的方法，在 DNA 水平或 RNA 水平对基因的结构和功能进行分析，从而对疾病做出诊断的方法。基因组学：对所有基因进行基因组作图、核算序列分析、基因定位、和基因功能分析的一门基因组：一个单倍体生物所有的全部 DNA。结构基因：编码 RNA 或蛋白质的核苷酸序列。转录单位：从启动子到转录终止子之间的 DNA 节段。基因表达：是指 DNA 携带的遗传信息通过转录传递给 RNA，mRNA 通过翻译将基因的遗传信息在细胞内合成具有生物功能的各种蛋白质过程。基因表达调控：指对基因组中某一基因或一些功能相近的基因表达的开启、关闭、和表达强度的直接调节。开放阅读框（ORF）：
2、始于起始密码子并终于终止密码子的一串密码子组成的核苷酸序列。启动子：与 RNA 聚合酶识别、结合和转录起始所需的 DNA 序列。SD 序列：mRNA 5 一端在起始密码子 AUG 上游311bp 处，含 A-G 短序列，容易与16SrRNA 3“ 一端含 U-G 序列互补配对的序列称为 SD 序列操纵子：由一组功能相关的结构基因连同其上游调控序列共同构成一个转录单位。重复基因：一段 DNA 序列有2 个或2个以上 ORF，可以编码两种或两种以上多肽链。质粒：细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状 DNA 分子。断裂基因：基因组由编码序列和非编码序列间隔组成。重复序列：多拷贝的相
3、同或近似 DNA 片段。分段基因组：病毒基因组由数条不同的核酸分子组成，多见于 RNA 病毒。重组 DNA：不同来源的 DNA，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的 DNA 分子的过程。重组 DNA 技术：在基因水平上，将目的 DNA 在体外重组于能自我复制的载体 DNA 分子上，然后将重组 DNA 导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的 DNA 片段或得到相应的蛋白质产物的过程。限制性核酸内切酶：识别和切割双链 DNA 分子特异序列的核酸水解酶粘性末端：指限制酶错位切开两条对称轴互补 DNA 双链所产生的末端平末端： 指限制酶错位切开两条对称轴互补 DNA 双链所产生的末端回文结构：指双链 DN
4、A 分子上按对称轴排列的反向互补序列载体：携带目的 DNA 片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运转工具多克隆位点（MCS）：指具备多个限制酶的单一识别位点克隆载体：能够携带目的 DNA 片段进入宿主细胞进行扩增获得大量目的 DNA 的一类 DNA分子表达载体：能够携带目的 DNA 片段进入宿主细胞进行扩增和表达，获得目的 DNA 蛋白质产物的一类 DNA 分子增强子：能加强其上游或下游基因转录的 DNA 序列遗传密码：mRNA 上按5到3方向排列的每三个核苷酸称遗传密码多顺反子：一个结构基因转录产生一条 mRNA，编码几条功能相关的多肽链单顺反子：一个结构基因转录产生一条 mRNA，编码一条多肽
5、链的生成顺式作用原件:凡能激活或阻遏基因转录的 DNA 序列反式作用因子：与顺式作用元件直接或间接相互作用，能调节基因转录活性的蛋白质因子。基因组文库：指含有某种生物全部基因随机片段的重组 DNA 克隆群。cDNA 文库：mRNA 经逆转录酶催化生成 cDNA 后，再将这些 cDNA 装入载体构建成的含各种 cDNA 克隆的克隆群T-A 克隆：Taq DNA 聚合酶在扩增目的 DNA 的同时能不依赖模板在扩增产物两端加上两个游离的“A” ，与切口处人工加上游离的“T ”的载体即 T 载体连接，这种克隆方式称定向连接：使外源 DNA 片段定向插入到载体分子中的克隆方案感受态细胞：细胞膜结构改变，
6、通透性增加并具有摄取外源 DNA 能力的细胞转化：将质粒或以质粒为载体的重组 DNA 分子导入细菌，使其在细菌体内扩增及表达的过逆转录 PRC：以 RNA 为起始材料经逆转录产生 cDNA，再以 cDNA 为模板进行的 PCR 扩巢式 PCR：先用一对外侧引物扩增含目的 DNA 的大片段，用扩增产物作为模板再用第二对内侧引物再进行扩增，大大提高扩增效率和产物的特异性。多重 PCR（multiplexPCR ）：在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。不对称 PCR：使用两种不同浓度的引物进行 PCR，生成单链 DNA 用于测序。P
7、CRSSCP：将 PCR 产物双链 DNA（dsDNA）变性为单链 DNA(ssDNA)，加样于非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于 DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与 ssDNA 序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA 带位置的差异即可反映出PCR 产物序列的差异。荧光定量 PCR：通过荧光信号对 PCR 过程中的产物量进行实时监制，精确计算出 PCR 的初始模板量循环阈值（Ct）：PCR 扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。核酸分子杂交技术：用标记的已知 DNA 或 RNA 片段（探针）来检测样品中未知核酸序列（形成异源
8、双螺旋） ，再经显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来。探针：是指能与特定核酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。Southern 印记杂交：检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 DNA 分子。Northern 印记杂交：检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 DNA 分子。菌落杂交：检测固定在膜上，经裂解从菌落体释放的 DNA 分子。斑点杂交：检测固定在膜上的 DNA 或 RNA 分子。原位杂交：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。Western 印记：检测经凝胶电泳分离并转移至膜上的蛋白质分子。基因
9、芯片（DNA 芯片，DNA 微阵列）：将大量的 DNA 片段有序的，高密度的排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。DNA 多态性：由于不编码蛋白质的区域和没有重要调节功能的区域发生中立突变，这些中立突变构成的 DNA 变异称为 DNA 多态性。STR：存在于非编码区或内含子中，以三个核苷酸为重复单位的高度多态性序列，是一个非常重要的遗传标记。SNP：单个核苷酸变异而形成的 DNA 分子多态。RFLP：由于基因的突变导致某一限制性内切酶的酶切位点序列产生或消失，经电泳分离出大小不同的片段。V-ONC 病毒癌基因：是病毒从宿主中获得的、以不同方式融合进入病毒结构基因中，使靶基因发生恶性转化
10、的特定 DNA 序列。C-ONC 细胞癌基因：存在于生物正常细胞基因组中与病毒癌基因结构相似的基因，激活或可导致疾病的发生。抑癌基因：存在于正常细胞中的一类可抑制细胞过度增长与增值的基因，有潜在的抑癌作用。当此类基因有突变、缺失、失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。染色体 DNA 与质粒 DNA 分离原理：利用染色体 DNA 与质粒 DNA 变性复性差异，加碱后两者都变性再加酸质粒 DNA 分子小，可复性，在用酚抽提PCR 反应原理：依据 DNA 变性与复性原理，在模板 DNA，引物和四种 dNTP 存在对的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促反映，有变性 退火 延伸三个步骤载体具备条
11、件:能自主复制，具备筛选标记，具备多克隆位点， （拷贝数高，有较高遗传稳定性，分子量小，易于转化，配备与宿主细胞相适应的调控元件如启动子，增强子）引物设计原则：1两条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列3末端互补。2长度为1840 个核苷酸。3 两条引物之间不应存在互补序列，避免形成引物二聚体。4引物的碱基组成应平衡。5引物的5 端可被修饰。化学裂解法测序：原理1.用放射性核素标记待测 DNA-侧链末端即3末端 2.将标记DNA 分为 G，A+G，C+T ，C4个反应体系 3.用不同的化学试剂处理不同反应体系，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的 DNA 片段的混合物
12、4.电泳分离，通过放射自显影可读出 DNA 序列原核表达载体分为：非融合型表达载体，分泌型表达载体，融合蛋白表达系统核酸分子杂交按作用方式可分为 固相杂交（菌落原位杂交，斑点和狭缝杂交，southern印记杂交，northern 印记杂交）液相杂交（吸附杂交，发光液相杂交，液相夹心杂交，复性速率液相杂交）OLA 原理：野生型等位基因的 DNA 变性为单链 DNA，等位基因特异探针和通用探针分别与之杂交，由于野生型等位基因特异探针与通用探针与靶序列完全互补，连接酶将它们连接成一条链，突变型等位基因通用探针与靶序列没有完全互补，因此连接酶不能将它们与通用探针连接起来。信号放大技术检测方法：液相杂交
13、检测方法，杂交捕获系统和支链 DNA 检测技术遗传性疾病分子诊断：直接诊断策略，基因多态性连锁分析，基因突变的定量，基因表达分析，mRNA 检测性描述乳糖操纵子的正负调控：结构：调节基因+启动子+操纵基因+ 结构基因；负调控：无乳糖时：调节基因表达，形成诱惑性调节 pro，并与操纵基因结合，阻止了转录；有乳糖时：调节基因表达，形成有活性调节 pro，但有活性的四聚体在小分子物质的变构调节的作用下，失去活性，形成无活性的四聚体，无法与操纵基因结合，基因能顺利的转录；正调控：低葡萄糖时，CAMP 浓度，与 CAP 结合成 CAMP-CAP 复合物，结合在CAMP-CAP 位点，促进结构基因的转录；
14、要让乳糖操纵子表达的基础：高乳糖、低葡萄糖质粒的特征：结构：时环状超螺旋 DNA 分子；自我复制；质粒具有不相容性，不同的质粒里同一个子细胞，彼此竞争，只有一种质粒稳定存在；可扩增性；可转移性：质粒可以从一种宿主细胞导入另一种宿主细胞；带有选择性标记：氨苄青霉素蓝白斑筛选：在 IPTG 的诱导下，产生具有完整酶活性的 -半乳糖苷酶，将无色的 X-gal 水解为蓝色产物，形成蓝色菌落，当外源基因插入 LaZ 基因的克隆位点，无 -互补能力，形成白色菌落，成为蓝白斑筛选核酸的分离与纯化遵循的原则：保持核酸一级结构的完整性；尽可能提高核酸品质的纯度核酸分离用酚抽提法，原理，以含 EDTA，SDS，R
15、NA 酶的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶 K 处理后，用 PH8.0的 Tris 饱和分抽提获得 DNA 粗制品核酸的纯化常用的方法：琼脂糖凝胶电泳法A260/A280是什么标志：核酸纯度标志，纯 DNA=1.8 纯 RNA=2.0核酸浓度的鉴定：紫外分光光度法（适用于浓度大于0.25g/ml 的核酸溶液）：核酸具有共轭双键，对波长260nm 左右的紫外光有教强的吸收特性； 在波长260nm 的读数，可用来计算样品中核酸的浓度，每 gDNA 的钠盐的吸光度值为0.02；A260=1时，双链DNA 含量为 50g/ml ；单链 DNA 或 RNA 含量为40 g/ml；单链寡核苷酸含量为33g/m
16、l在基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳中，发生拖尾，提示什么：少量 DNA 降解在点 RNA 的琼脂糖凝胶电泳中，点样孔附近有着色带说明什么：有少量 DNA 存在分离纯化后的 DNA 的保存：一般将 DNA 保存于 pH=0.8的 TE 缓冲液中，减少 DNA 的脱氨反应，抑制 DNA 酶的活性，使 DNA 在-70，可储存5年以上分离纯化后的 RNA 的保存：是抑制 RNA 酶，加入焦炭酸二乙酯，VCR 等碱裂解法提取质粒时，溶液、，酚氯仿，无水乙醇，70%乙醇溶液的作用：溶液(EDTA) ：为二价金属离子螯合物，可以螯合 DNA 酶激活所需要的 Mg2+、Ca2+等二价金属离子，从而抑制 D
17、NA 酶的活性，并且有降低细胞膜稳定性的作用；溶液(SDS)：使 pro 变性、解聚和降解 DNA 酶的活性，主要作用是降解细胞反复化脂质和pro，使其具有结合的物质沉淀，从而达到分离作用；酚：一种强蛋白变性剂，可使 pro变形、沉淀，也可抑制 DNA 酶的活性；Tris(pH=8.0)：使 DNA 能顺利进入水相而避免其滞留于蛋白质层；无水乙醇：有盐的条件下，沉淀核酸，利用核酸与 K、Na、Mg、Li及铵根等阳离子形成盐，屏蔽了带负电 PO43-集团，使核酸分子聚集在一起而不溶于有机溶剂的特性；70%、75% 的乙醇洗涤：盐类可使核酸沉淀，但往往含有少量共沉淀的盐，用其洗涤出去盐类试述 PC
18、R 反应原理既反应体系：变性退火延伸荧光定量 PCR 原理：FQ-PCR 反应体系中加入荧光集团利用荧光信号对 PCR 过程中的产物量进行实时监测，将待检样品与一系列稀释的标准对照一起扩增，获得 PCR 过程的动力学曲线，通过标准曲线精确的计算出 PCR 初始模版浓度荧光定量 PCR 中荧光产生机制：探针类（Taqmam 探针） ；非探针类：荧光染料与所有的 DNA 双链结合，对 DNA 没有选择性、特异性没有探针类好TaqMan 探针：包括一对引物和一条探针，探针只与模板特异性结合，其结合位点在两引物之间，5 有荧光报告基因3 荧光卒灭基因。随 PCr 进行，Taq 酶在链延伸过程中遇到与模
19、板结合的探针，外切酶活性将探针切断，报告集团原理淬灭集团，产生荧光信号。重组 DNA 技术的目的和基本步骤：目的：获得目的基因的大量拷贝，进一步获得表达产物；基本步骤：分离载体和目的基因；切割载体和目的基因；连接载体和目的基因形成一个重组 DNA；转化：将重组 DNA 导入受体细胞；筛选出含有重组 DNA 的阳性克隆作为基因工程重组 DNA 技术的克隆载体所具备的条件：具有复制能力，保证重组DNA 在宿主细胞内独立复制；具有筛选标志：抗药性、酶基因；具有多克隆位点供外源 DNA 片段插入； 具有较高的遗传稳定性；具有较多的拷贝数；分子量小，易于转化；（表达载体的条件）配备与宿主相适应的调控元件
20、，如启动子、增强子和前导序列DNA 重组技术基本步骤：目的基因获取载体的选择将肽基因与载体进行特异性切割目的基因与载体连接或重组 DNA重组的 DNA 分子导入相应的宿主细胞在宿主细胞中无性增殖，经过筛选获得阳性重组体蛋白质的分离（二维凝胶电泳）原理：等电聚焦凝胶电泳：利用特殊的一种缓冲液在凝胶内制造一个 pH 梯度，电泳的每种 pro 就能将迁移到二等电点 PI 的 pH 出，此时的 pro不再带有净的正或负电荷，形成一个很窄的区带；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS 与蛋白质的疏水部分相结合，这种负荷远超过蛋白质分子原有的电荷，从而减低或消除了各种蛋白质分子天然电荷差异，在有 SDS 存在
21、下的 SDS-PAGE 只按照蛋白质分子量的大小分离而不是所带的电荷量分离蛋白质-核酸间相互作用的研究：凝胶滞后实验：a.利用凝胶滞后实验可以评价 pro 与核酸结合的特异性；b.原理：蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，电泳的这种复合物较无蛋白结合的探针在凝胶中的泳动速度要慢而表现相对滞后；DNAase足纹分析：a. 是目前广泛用于蛋白质精确结合位点研究的方法；b.原理：是 DNAase可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键，将 DNA 切成单核苷酸，而结合有蛋白质的 DNA 免于DNAase的水解；核酸-pro 杂交试验：常用语蛋白质与 DNA 的特异性结合还可以确定结合蛋白质的相对分子量
22、探针的种类：根据标记方法不同分为：放射性探针、非放射性探针；根据性质及来源不同分为：基因组 DNA 探针、CDNA 探针、RNA 探针、寡核苷酸探针探针的标记物：放射性核素标志物：32P、35S、3H；非放射性标志物：生物素、地高辛、酶、荧光素核酸探针的标记方法：酶促法标记核酸探针：缺口平移法：DNA 聚合酶 I；随机印务法：DNA 聚合酶； 3 端标记：限制酶 -5端突出的粘性末端 -klenowDNA 聚合酶补平；RMA 标记：RNA 聚合酶；股核苷酸链探针的标记；化学法标记核酸探针：光敏生物素标记核酸探针；酶标记核酸探针核酸分子杂交类型及检测目的：southern 印记杂交：检查经凝胶电
23、泳分离且转移至膜上的 DNA 分子； northern 印记杂交：检查经凝胶电泳分离且转移至膜上的 RNA 分子；检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的蛋白质分子；斑点杂交与狭缝杂交；原位杂交southern blot 基本步骤：酶切已纯化的待测 DNA凝胶电泳分离变性转移至固体支持物预杂交封闭非特异位点探针与同源 DNA 片段杂交漂洗去除非特异性结合的探针检测及结果分析FISH 探针类型：着丝粒探针：用于检测染色体数目异常 优点：高重复性，杂交时间短，不需特殊染色体识别；染色体涂抹探针：可用于检测染色体数目或结构异常；染色体单一序列探针：主要用于识别染色体的易位、缺失和扩增；端粒重复序列探针：用以
24、检测染色体数目异常双脱氧链终止法基本原理：利用 DNA 聚合酶，以单链 DNA 为模板，以 dNTP 为底物，在四组相互独立的反应体系中分别加入不同的双脱氧核苷磷酸作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成丝足有序列梯度的互补 DNA 链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测 DNA 的序列Sanger 与 PCR 的同异：都在体外，都有 DNA 聚合酶。目的差异（ PCR：扩增，实验DNA 片段扩增。Sanger:测序，对待测模板链测序。 ）体系差异（ PCR：以两条链分别作为模板。Sanger：以其中一条链作为模板。 ）五要素，引物，原
25、料，dNTP，Taq 酶，mg2+ 缓冲液 S 以其中一条作为模板，引物，DNA 酶，dNTP 步骤：P 琼脂糖凝胶电泳 S 聚丙烯酰胺电泳待测反应体系的组成：待测模板：单链或双链 DNA 模板；测序引物；DNA 聚合酶；dNTP 的放射性核素标记；测序产物的凝胶电泳与识读未知序列的从头测序策略：随机测序法（乌枪法、人工转质子法） ；定向测序法（引物步入法、嵌套缺失法）生物芯片：概念：通过微加工技术和微电子技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将生命科学研究中的若干部联系过程，继承于几平方厘米的芯片上，并使这些分散过程连续化与微型化以实现对大量生物样品中个数据的快速、自动化和并行处理；特点：
26、高通量、集成化、并行化和微型化生物芯片的分类（按结构特点）：微阵列芯片(基于生物分子之间的亲和结合作用 )-基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片；微流体芯片(微流控操作与分析)-毛细血管电泳芯片、PCR 反应芯片、介电电泳芯片基因芯片技术主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应、检测分析基因芯片制备固定方法：原位合成、喷印合成法、分子印章原位合成蛋白质芯片的分类：按工作原理：探针芯片、凝胶电泳芯片；按作用分：蛋白质表达芯片、蛋白质功能芯片；按活性分：无活性蛋白质芯片、活性蛋白质芯片基因变异检测技术方法比较：PCR-ARMS 、PCR-OLA 适用于已知点突变，TGGE、DHPLC 可用于位置
27、点突变；TGGE、DHPLC 灵敏度高，DHPLC 可自动化快速检测；PCR-ARMS 简单易行，但不能用于复杂的突变检测感染性疾病分子诊断的策略：一般性检出策略：针对某种特异性的核酸序列通过核酸分子探针杂交，或靶分子扩增技术直接检出微生物的 DNA/RNA；判断有无感染和是何种病原体感染；完整性检出策略：按照诊断分型亚型耐药性检测的思路，利用多种基因诊断手段对感染病原体进行分析感染性疾病分子诊断的常用方法：信号放大技术检测方法：分支 DNA 信号放大系统、杂交捕获系统、液相杂交；【特点】：a.靶核酸本身不被扩增而是通过多个探针组成逐致信号放大体系，放大靶核酸信号；b.主要优点表现在犹豫是多目
28、标核算进行直接检测，污染小，重复性好，稳定性好；c.缺点是不如 PCR 等扩增技术灵敏，监测的范围也狭窄；靶分子扩增技术：以 PCR 为基础的扩增方法、代替的扩增方法、探针扩增系统临床应用及评价：弥补血清学检测技术缺陷；检测不能培养成生长缓慢的病原微生物；通过病原微生物的定量检测监测疾病；耐药性的检测；细菌分型及流行病学调查遗传性疾病分子诊断的策略：直接诊断策略：致病基因突变检测，即直接揭示导致遗传性疾病发生的各种遗传缺陷；基因多态性分析：在先证者中确定具有遗传缺陷的染色体，相关基因的等位基因型和单位体型等，然后再该家族其他成员中寻找能被检者是否也有该染色体相关基因的等位基因型和单倍体型；基因
29、突变的定量诊断：检测大范围的重复或缺失，mRNA 检测等；基因表达分析：mRNA 检测原癌基因编码产物分类：生长因子类：sis 基因；酪氨酸蛋白激酶类：isrc 基因；DTP 结合蛋白类：ras 基因； 核蛋白类：myc 基因； 端粒酶：端粒酶基因原癌基因的活化机制：病毒癌基因转导；插入突变病毒诱导活化；原癌基因突变；染色体易位或基因重排；原癌基因扩增；原癌基因甲基化程度降低抑癌基因的确定条件：癌细胞中一堆等位基因同时失活；野生型基因导入该基因缺陷的恶性肿瘤细胞中，将部分或全部抑制恶性表型；在肿瘤的相应正常组织中必须有正常的表达；在恶性肿瘤中相应基因有所改变，包括点突变、片段缺失或基因易位、基
30、因重组等抑癌基因的失活机制：染色体丢失；基因突变；甲基化表现遗传改变抑癌基因常见种类：Rb 基因（视网膜母细胞瘤易感基因）：【定位】：第13号染色体长臂（第一个发现的抑癌基因） ；【功能】：编码产生的 p105RB 为核蛋白，可与 DNA 结合，属于反式作用因子；p53基因（基因卫士）：功能：抑制细胞增殖，阻断细胞进入S 期，促进 DNA 损伤修复，促进细胞凋亡蛋白质组学：是指对在特定是时间和环境下所表达的群体蛋白质研究的一门学问，主要在蛋白质水平上探索蛋白质的表达模式，作用模式，功能机制，调节控制一集蛋白质群体内的相互作用。它是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，并从一个机体或一个细胞
31、的蛋白质整体活动来揭示生命的规律。PCR-SSCP：将 PCR 产物双链 DNA 变性为单链 DNA 加样于非变性聚丙烯酰胺进行电泳，由于 DNA 分子在凝胶中电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与 ssDNA序列有关因此电泳结束后 ssDNA 带位置的差异即可反应出 PCR 产物序列的差异Southern 步骤：1SDS 裂解细胞膜- 蛋白质水解 分层 -离心2基因组 DNA 经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳3将含有 DNA 片段的凝胶放入变性电泳溶液使 DNA 变性 4将固有支持物放在胶上通过毛细管虹吸或电转移将胶上的 DNA 片段转移到固相支持物上，转移过程中各 DNA
32、 片段之间的相对位置保持不变，然后通过加热使 DNA 固定于膜上5 加入探针使之与膜上的 DNA 杂交6 冲洗未杂交的探针，检测杂交信号放射自显影限制性核酸内切酶：识别 DNA 特定序列切断 DNA 链DNA 聚合酶 I：1 缺口平移制作高比活探针2 合成 cDNA 的第二链3填补双链 DNA3”末端4cdna 序列分析点突变的诊断：对基因背景清楚地点突变（ASO，ELISA，ASA ，RFLP，基因芯片技术）对一些基因背景未知的点突变（SSCP，DGGE，HA，DNA 序列测定，PTT）DNA：核酸分子杂交，PCR，DNA 测序，基因芯片RNA：逆转录 PCR，荧光定量 RT-PCR,NOR
33、THERN，CDNA 芯片（文库）蛋白质：WESTERN ，蛋白质组织化学染色，ELISA ，蛋白质芯片与 PCR 异同点：（同）都在体外，都有 DNA 聚合酶（异）目的：P 扩增（实验 DNA 片段的扩增）S 测序（对待测模板链的测序）体系：P 以两条链分别作为模板， FISH 探针：利用非放射性的荧光信号对原位杂交进行检测的技术HBV：乙肝病毒，DNA 病毒。6个月病毒被完全清除，5%-10%成为持续感染或慢性肝炎。病毒基因组结构的变异性：HBV 基因组有4个 ORF：S.C.P.X。均可发生变异。前 C 基因、C 基因 C 启动子变异，变异后病毒感染者血清 HbeAg 阴性，但 HBV
34、DNA 仍复制。分子诊断方法：1信号放大技术2.PCR 法耐药性检测HCV：丙肝病毒，RNA 病毒。分子检测方法：用于 RNA 定性及定量检测。1、RT-PCR 技术2，转录介导扩增系统3，bDNA 技术。分子鉴定方法：1，逆向杂交多列探针检测法2，直接 DNA 测序3，实时荧光定量 PCRHIV：逆转录病毒科 RNA 病毒。分子诊断方法：1，病毒载量检测：RT-PCR。2 ，病毒表形和耐药性检测。基因芯片的应用：寻找和发现新的基因；基因表达分析；DNA 序列测定与序列间比较；突变体和多态性检测；疾病的诊断蛋白质芯片的应用：抗原-抗体反应筛选；蛋白质表达筛选；发现新的疾病标志物作为临床诊断指标
35、；对疾病病理分子机制的研究；筛选药物靶点点突变诊断RFLP：用 PCR 扩增限制性片段长度多态性位点周围的 DNA 片段，扩增后用相应的内切酶进行切割。ASPCR：（PCR 扩增阻碍突变系统）等位基因特异性 PCR 检测已知点突变的方法1设计两对引物（一对引物与正常基因匹配，另一对引物与变异基因匹配）这两对引物中一条引物完全相同，而另一条有差异。2若模板为正常基因，则与模板匹配的引物可以导致 PCR 大量扩增3利用两对引物分别扩增样本，就可以根据 PCR 产物有无判断对何种基因呈扩增阻碍，从而分析基因是否变异。OLA：寡核苷酸链接实验可检测基因突变1检测将靶序列直接进行连接反应2每个连接反应需
36、要两个相邻探针和 DNA 聚合酶3 两个探针邻接位点正好是点突变位点，探针与靶序列杂交4完全互补 4双等位基因变异，三个探针DGGE：（变形梯度凝胶电泳）基于双链 DNA 在发生部分变异后其电泳迁移率会显著降低的原理。DHPLC：（变性高效液相色谱分析法）具有灵敏度，可以检测各种类型的突变，高自动化且高通量的突变检测方法，通过改进传统的分离系统，运用变温分析方式，具有无法比拟的生物大分子分离优势。特征 原核生物 真核生物 病毒核酸组成 DNA、RNA DNA、RNA DNA 或 RNA基因组大小 较少基因数目较少 较多基因数目多 基因数少，不同病毒结构基因特点 多顺反子 mRNA；无内含子；编码序列不重叠单顺反子断裂基因非编码区多于编码区重复序列5端有帽子结构，3 端 ployA，两端具粘性末端，重叠基因分段基因组其他特征 环状双链 DNA，只有一个 DNA 复制起点，只有具类核结构，具有操纵子结构线状双链 DNA；二倍体 双链 DNA 分子两端有正向重复和反向重复序列DNA 体内复制与 DNA 体外复制条件上的区别：DNA 体内 DNA 体外模版 DNA 两链 DNA 双链解旋酶 需要 不需要引物酶 需要 不需要dNTP 需要 需要DNA-pol 需要 耐热 DNApolpH 细胞内液 PCR 缓冲液
